2022 Fiscal Year Annual Research Report
Tailer made-dual directed immunotherapy for pancreatic cancer
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21H04833
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 学長特命教員(特別顧問) (20191190)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川井 学 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (40398459)
岡田 健一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50407988)
勝田 将裕 和歌山県立医科大学, 医学部, 非常勤講師 (50464673)
尾島 敏康 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60448785)
廣野 誠子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60468288)
宮澤 基樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90549734)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| Keywords | がんワクチン / iPS細胞 / 樹状細胞 / ネオアンチゲン / ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵癌患者iPS細胞からiPSDCsの分化誘導を行い，CTOS cell lineの確立を行った．3名の膵癌患者ドナーの末梢血単核細胞からiPS細胞の樹立を行った．iPS細胞をMatrigelコートしたdishでフィーダーレス培養を行い，5ステップ法でiPSDCsへ分化誘導を行った．膵癌患者iPSDCsとBMDCsの成熟能を比較検討するためにそれぞれの未成熟，成熟DCsにて表面マーカーの発現（CD11c，CD80，CD83，CD40，HLA-ABC，HLA-DR）をflow cytometryにて比較検討した．さらに膵癌患者iPSDCsとBMDCsのサイトカイン分泌能を比較検討するためそれぞれの未成熟，成熟DCsにてサイトカインの分泌（IFN-γ，IL-12p70, TNF-α）をELISA法にて比較検討した．膵癌患者より樹立したiPSDCsはBMDCsと同様にmaturation cocktailにて成熟し，表面マーカーであるCD11c，CD83，HLA-ABCの同程度の発現を認めた. CD80，CD40，HLA-DRについてはiPSDCsにおいて発現が低かった．さらに3名の膵癌患者ドナーよりCTOS法にて，癌スフェロイドを樹立した．ドナーより摘出した癌組織を細断したのちに，Liberase DH solution (Roche Diagnostics)を加え2時間溶解分離した．この溶解過程でsingle cellとならず細胞間接着を維持したままの細胞塊を100μmおよび40μmのcell strainerを用いて回収し，培養することで癌スフェロイドの樹立を行った．3名の膵癌ドナーの癌組織からいずれもCTOSの樹立が可能であった．腫瘍細胞マーカーであるEpCAMの高い発現を確認した．またCD45の発現は認めなかった．3名のドナーのうち1名においてCEAの高い発現を認めた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膵癌切除標本からのCTOS細胞の確立に難渋していたが，培養法を改良することにより作成が可能で可能になった。また膵癌患者３ドナーから順調にiPS樹状細胞の誘導ができており，今後は研究計画通りの免疫学的解析を行うことで研究は完遂する．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究予定は下記である．
腫瘍（CTOS）および正常組織(PBMCs)を次世代シーケンサーによりwhole exome解析し，腫瘍特異的な遺伝子変異を同定する．遺伝子変異により発生しうる変異ペプチドをin silicoにて予測する．これらの予測された変異ペプチドの中から，HLA分子との親和性が高く，RNAシーケンスにより発現量が多いと予測されたペプチドを選出し合成を行う．1ドナーから20～30種類のNeoantigen由来ペプチドを想定している。
選出した変異ペプチドに対して，ELISpot assayを用いたバリデーションスタディを行う．ELISpot assayでは腫瘍由来のRNAを導入したiPSDCs (iPSDCs-CTOS ivtRNA)により誘導されたCTLsが，変異ペプチドに対して免疫応答するかを検証する．また，選出した変異ペプチドをiPSDCsに直接パルスすることでiPSDCs-neoantigen peptideを作成し，これにより誘導したCTLsが変異ペプチドに対し免疫応答するかについても検討する．この解析で良好な結果が得られれば，膵癌ネオアンチゲンに免疫応答するiPS樹状細胞ワクチン療法の現実可能性が立証される．
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