2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel antifungal peptide based on rice-derived bioactive peptide
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21K05410
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Research Institution | Niigata University |
Principal Investigator |
落合 秋人 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (40588266)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | ディフェンシン / 抗菌ペプチド / 作用メカニズム |
Outline of Annual Research Achievements |
現在使用されている抗真菌薬は、その作用メカニズムにおいて類似していることから、さらなる有効な新薬が必要とされている。研究代表者は、既存の抗真菌薬とは異なるメカニズム、即ちアポトーシスを誘導することにより真菌を殺菌するペプチドOsAFP1をイネから見出した。また、その部分配列からなる短鎖ペプチドpeptide-8は、元ペプチドと同様のメカニズムにより抗真菌作用を示すことを明らかにした。本研究課題においては、口腔内感染症に対する新しい治療法を開発するための基盤技術の構築を目指す。研究計画1年目において、以下に挙げる成果を得た。 [1] OsAFP1の抗真菌作用メカニズムの解析……抗菌作用の初期段階であるターゲット分子との相互作用からアポトーシス誘導に至る経路を解析することを主題とし、OsAFP1短鎖ペプチドを酵母細胞に処理してトランスクリプトーム解析を行った。その結果、64個の遺伝子において2倍以上の遺伝子の発現上昇、34個の遺伝子において1/2倍以下の発現減少が確認された。GO解析の結果、イオン輸送や細胞の形態維持に関わる遺伝子発現が促進されることがわかった。殺菌活性試験などの結果と合わせると、OsAFP1は細胞膜の不安定化を引き起こし、何らかの経路を経てアポトーシスを誘導することが示唆された。 [2] peptide-8ベースの新規抗真菌ペプチドの創生……peptide-8をベースに改良を行い、高活性型新奇ペプチドを創出することを主題とする。peptide-8の前後領域を付加および削除した合計10種類のペプチドを設計して解析した結果、peptide-8より4倍高い活性を保持した短鎖ペプチドpeptide-8+3-2を得ることができた。顕微鏡観察および殺菌活性試験の結果から、peptide-8+3-2はOsAFP1同様の抗真菌メカニズムを有していることが示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した研究計画[1] OsAFP1の抗真菌作用メカニズムの解析において、OsAFP1短鎖ペプチドと酵母細胞を用いたトランスクリプトーム解析が終了した。酵母においてはその非必須遺伝子6000個の破壊株が市販されており、今後これらを用いたトランスクリプトーム解析の検証実験を進める。また、FITCをペプチドに付加させることにより、蛍光観察法により真菌細胞内におけるOsAFP1の局在性を高感度で観察する手法を確立した。これらの実験により、抗真菌作用メカニズムの解明が促進すると考えられる。一方で、研究計画[2] peptide-8ベースの新規抗真菌ペプチドの創生においては、当初の予定どおりOsAFP1の活性に匹敵する高活性な短鎖ペプチドを得ることができた。今後はX線結晶解析や既存の構造情報を用いてより高活性な変異型ペプチドの設計を進める。
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Strategy for Future Research Activity |
研究計画[1]において、出芽酵母非必須遺伝子破壊株6000株の全株をプールし、OsAFP1を処理することにより耐性株を取得する。変異遺伝子(即ちOsAFP1の作用経路に関与する遺伝子)を次世代シーケンサなどで網羅的に同定し、抗真菌メカニズム発現に関わる経路を同定する。また、FITC結合短鎖ペプチドを合成し、蛍光観察法により真菌細胞内におけるOsAFP1の局在性を高感度で観察する。これら2つの実験を合わせて、真菌細胞壁膜におけるOsAFP1のターゲット分子からアポトーシス誘導への経路を詳細に明らかにする。 また、研究計画[2]においては、NMRおよびX線結晶構造解析を用いて、OsAFP1の直接的なターゲット分子であるPI(3)Pとの相互作用を解析する。NMRは主にpeptide-8とPI(3)Pとの相互作用の解析に使用し、PI(3)P存在下において化学シフト値が大きく変化したアミノ酸残基を特定する。一方で、OsAFP1においては既にアポ型のX線結晶構造を報告済みであるため、アポ型結晶へのソーキングもしくは共結晶化を行い、PI(3)Pとの複合体結晶を調製してX線結晶構造解析進める。これらの解析により、PI(3)P との相互作用に関わるアミノ酸残基を特定し、これら残基に対して変異を導入することにより抗真菌活性が向上した変異体を獲得する。
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Causes of Carryover |
【理由】予算計上した備品について、該当製品が品薄状態にあり価格も上昇していることから、当初配分予算では購入が困難となった。その結果、次年度繰越額が生じた。現在代替品の見積を取得している段階である。この備品を除いて、次年度における残額の使用計画は立っており、ほぼ予定通りに執行されている。 【使用計画】最終年度は、上記使用計画のほか、短鎖ペプチドのペプチド合成、微生物やヒトHEK細胞の培養に使用する器具・試薬、および変異体タンパク質の調製に使用するDNA関連試薬などの購入に充てる。また、NMRやX線結晶構造解析に必要な器具・試薬、およびX線回折データの取得のための大型放射光施設への旅費などにも充てる予定である。
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Research Products
(2 results)