2021 Fiscal Year Research-status Report
カンピロバクターの新たな運動性評価法の開発と運動阻害物質のスクリーニング
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21K05446
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| Research Institution | Kanagawa Institute of Technology |
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Principal Investigator |
澤井 淳 神奈川工科大学, 健康医療科学部, 教授 (80288216)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | カンピロバクター / 食中毒 / 運動性 / 移動性 / バイオフィルム / 抗菌物質 / ろ紙 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カンピロバクター(C. jejuni)は、極めて高い運動性を有し、表面から食品内部へ移動することから、食中毒の防止にはC. jejuniの運動性を阻害することが有効である。本研究では、従来の2次元での細菌の運動性評価ではなく、濾紙を利用し食肉・食材中への移動を想定した細孔中での3次元条件下での運動性＋バイオフィルム(BF)形成能の評価方法の確立を第一の目的とする。そして、この評価方法を利用し、C. jejuniの運動性の阻害に有効な天然抗菌物質等のスクリーニングを行う。2021年度においては、ろ紙を用いたC. jejuniの運動性の評価方法を検討した。
前培養したC. jejuniはCCDA培地に、大腸菌および枯草菌は普通寒天培地に前培養液を塗布し培養した。形成したコロニーに滅菌したニトロセルロース製のろ紙 (孔径: 0.2, 0.3, 0.45, 1.6, 20-25 μm)を1枚から11枚と重ねて置き、C. jejuniは微好気条件で、大腸菌および枯草菌は好気条件で培養した。
C. jejuniは、0.2～0.45 μmの孔を通りろ紙表面でBFを形成した。ろ紙上にC. jejuni が存在することも電子顕微鏡およびグラム染色により確認できた。さらに孔サイズ0.2μmでは1枚、0.3 μmおよび0.45 μmでは9枚までろ紙の孔を通り、BF形成することが可能であった。一方、大腸菌および枯草菌ではC. jejuniと異なり0.45 μmまでの孔サイズで移動できず、1.6 μm以上の孔サイズが必要であった。
以上の結果より、寒天を使用した2次元における評価では差がつきにくいC. jejuniと大腸菌、枯草菌の運動性をろ紙を使用することで差別化することができ、本法がC. jejuniの新たな運動性の評価方法として利用できる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度は、以下の評価方法がカンピロバクターの運動性の新たな評価方法として妥当かどうかを検討することが目的であった。
「前培養したCampylobacter jejuniをCCDA培地に塗布し、微好気条件で培養し、C. jejuni のコロニーを形成させる。形成させたコロニーの上にろ紙を置き、さらに微好気条件で培養する。C. jejuni は濾紙の細孔を通りぬけ（垂直方向への移動）確認する。」
検討項目は以下である。①細孔径、②移動距離（ろ紙を重ねる）、③他の鞭毛を有する細菌、④培養温度、⑤ろ紙の親水性、⑥BFを形成後の菌の確認は、グラム染色による顕微鏡観察（らせん状桿菌の存在の確認）、⑦BFの表層構造、形成している菌の細胞の状況を電子顕微鏡（SEM）にて観察。
①~③、⑥、⑦は実施出来た（研究実績の概要参照）。コロナ禍でろ紙の供給が逼迫し入手が難しくなったが、残りの④、⑤については、以下の理由で評価する上では深く検討する必要はないと判断した。
④ 培養温度については、温度を下げると培養に非常に時間がかかり（2回の培養で1週間以上）、評価方法としては35-37℃の適温で実施するのが望ましいとして実験を進めた。⑤ ろ紙の親水性のついては、疎水性の強いろ紙は、寒天培地上で反り返ってしまい、実験が進めることができず、この影響を見ることは中止した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の成果を踏まえ、2022と2023年度は以下に示す計画ですすめる。
運動性を阻害する抗菌物質および物理的処理方法のスクリーニング（2022年度）：カンピロバクターの運動を阻害する抗菌物質のMIC測定：抗菌物質としては、ポリフェノール、焼成貝殻カルシウム、エッセンシャルオイル、消毒用アルコール、次亜塩素酸Na等を想定している。物理的手法としては、紫外線処理等について検討する。
抗菌物質はMICの濃度をもとに溶液を調製し、CCDA培地に形成したC. jejuni のコロニーに、霧吹きで噴霧する。噴霧後のコロニー上にろ紙を置き、微好気条件で培養する。物理的処理は、C. jejuni のコロニーを形成させたCCDA寒天培地に処理を行い、コロニー上にろ紙を置き、微好気条件で培養する。C. jejuniの運動性の評価として、ろ紙上に移動してコロニーを形成できるかどうかを測定する。測定はろ紙上のコロニーを白金耳で釣菌し、C. jejuni が到達できているかをグラム染色による顕微鏡観察にて確認する。また、ろ紙を重ねることで移動距離も評価する。以上より、処理の効果を濃度、移動距離、BFの形成能から判定することが可能と考える。
実食肉における評価（2023年度）：2022年度のスクリーニングの結果を踏まえ、食肉表面にC. jejuni を塗布する。天然抗菌物質および物理的処理を行い、ろ紙を載せ培養し、運動性が阻害できているかどうか検討する。また食肉表面をトリミングし菌体が食肉内部へ侵攻しているか、C. jejuni の菌数を測定し、未処理のものと比較する。以上、3年間の成果をもとに、運動性を阻害するという新たなカンピロバクターの制御方法を提示することを目的とする。
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Research Products
(1 results)
