2022 Fiscal Year Research-status Report
Plant monitoring by apoplastic reactive oxygen species
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21K05854
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
安保 充 明治大学, 農学部, 専任准教授 (00272443)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 紳一郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 主任研究員 (10415739)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アポプラストROS / ストレスモニタリング / 植物根 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は植物根のアポプラストROSの計測により、植物の状態把握を試みるものである。前年度の実験結果から、ニトロキシル蛍光プローブを用いたダイズアポプラストROSの計測が感度・再現性よく行えることを確認できたので、今年度はその他の植物種の芽生えを用いて実験を行った。バッチ式で1時間プローブ溶液(300μM)にインキュベートすることで、チシャでアポプラストROSの確認ができたが、キュウリではプローブの分解が確認された。シロイヌナズナでは再現性よくROSを確認するには至っておらず、現在も検討中である。
次に、経時計測が可能なフロー系の実験では、PDMSを用いたplant chipを作製して分析を行った。検出器としてHPLCの蛍光検出器を用いる系では十分な再現性が得られなかったが、蛍光顕微鏡を用いた流路上の定点観測では再現性のあるデータが得られた。具体的には1.8 mmの流路にダイズ根端を設置し、プローブ溶液を0.5 ml/hで送液した。アポプラストROSの確認のため、DPI (NADPHオキシダーゼ阻害剤)の有無で蛍光を比較したところ、コントロールではアポプラストROSの蛍光が増加したのに対し、DPI添加では植物をインキュベートしないブランク溶液と同様に蛍光強度の変化は見られなかった。さらに、3%NaClストレスを負荷したところ、10分程度で蛍光強度がバックグランドレベルまで低下した。一方、1%NaCl ストレスの場合は、蛍光強度が一旦上昇したのちに低下したが、バックグランドレベルまでは低下しなかった。その他、キチンなどのエリシター処理によるストレスではアポプラストROSは緩やかに上昇し続けた。以上のように、ストレスに対するROSの放出パターンを一部類型化できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ダイズを用いてアポプラストROSのフロー系モニタリング手法を確立できた点で、研究は順調に進捗したが、植物種によってアポプラストROS量が異なり、植物種によるデバイスの最適化などの検討事項が増加し、当初の予定よりも時間を要すると考えられる。また、アポプラストROS量が極端に異なる個体など、植物個体による個体差を標準化してデータを取得する部分にも時間を要した。
なお、蛍光顕微鏡を用いた局所的なアポプラストROSの経時変化観察では、ダイズ根の自家蛍光を避けて蛍光を計測する必要があるが、モニタリング時間内に根が大きく動くことが問題であり、ダイズよりも根の小さな植物種を用いた実験への変更が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本手法の汎用性を示すために、チシャ、トウモロコシ、シロイヌナズナなどの他の植物種でも同様なアポプラストROS放出の類型化が可能かどうか検証する。その際、先述のように植物根の大きさに適したデバイスの作製を行い、ストレス負荷時のアポプラストROSのモニタリングデータを取得する。
一方、蛍光顕微鏡を用いた局所的なアポプラストROSのモニタリングでは、植物根の動きを制限するようなガイド付きのplant chipを作製するか、ゲル等で固めて動きを制限させてモニタリングデータを取得できるか検討を行う。また、植物の状態把握として根の形態観察とアポプラストROS量を関連付けるデータの取得も試みる。
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| Causes of Carryover |
消耗品などの消費税の端数などの残額であるため、次年度の消耗品と合わせて使用することを選択した。
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