2022 Fiscal Year Research-status Report
Functional characterization of Myc-depedent ribosomes by Ribo Mega-SEC coupled to mass spectrometry-based proteomics
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21K06138
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
吉川 治孝 徳島大学, 先端酵素学研究所, 助教 (60709567)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リボソーム / がん / プロテオーム解析 / サイズ排除クロマトグラフィー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リボソームは生物に必須の細胞内翻訳装置である。がん細胞はリボソーム合成を活性化させてリボソーム量を増やし、その成長と増殖に必要なタンパク質量を確保する。転写因子Mycはリボソームの全構成成分の遺伝子転写と、リボソーム自体の合成に必要なタンパク質群の遺伝子転写を促進することで、リボソーム量の増加に寄与する。本研究では、Mycによるリボソームの質的変化とそれに起因する翻訳能の変化も細胞がん化に関わるのではないか？という仮説のもと、Myc依存的なリボソームとの相互作用タンパク質の変化を系統的に解析することを目的としている。
昨年度は最新のuHPLC装置を用いてさらなる最適化を行なうことで、従来よりも高感度・高再現的なリボソームの分離法を確立している。そこで本年度は本手法を用いて、Myc発現依存的なリボソーム構成成分の変化をより高深度で解析することを試みた。
薬剤添加によりMycを発現する神経芽腫細胞株に対して薬剤処理・未処理を行ない、細胞を可溶化後にRibo Mega-SECにより分離することで翻訳が活発なポリソーム画分を得た。その画分に含まれるタンパク質を精製後、トリプシンによる消化によりペプチドを生成し、LC-MS/MS解析を行なった。その結果、2800以上のタンパク質の同定と定量に成功し、Myc発現依存的に変動するリボソーム相互作用因子群を特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の計画では、リボソームタンパク質およびリボソーム相互作用因子群の網羅的同定を確立し、同定したリボソームタンパク質およびリボソーム相互作用因子群の翻訳における機能解析をスタートする予定であった。そのため当初の計画からはやや遅れているものの、研究プロジェクト全体を通して見ると着実に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
特定したリボソームタンパク質およびリボソーム相互作用因子がポリソーム構造の形成に及ぼす影響、そして翻訳に及ぼす影響を検証する。具体的にはsiRNAによりノックダウンやCrispr-Cas9によるノックアウト実験を行なうことで評価する。最終的にはMyc依存的なリボソームの質的変化とその実体の解明につなげる。
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| Causes of Carryover |
確立したリボソーム相互作用因子の網羅的解析の実験は条件検討および再現性の確認のために繰り返し行なう予定であった。また得られた結果から特定したタンパク質に対する抗体を購入する予定であった。しかし本年度は当初の計画からやや遅れたため、上記実験に必要な費用が当初の計画よりも少なくなり、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費とあわせて、本年度にすることができなかった実験の費用に充当する予定であり、これらの解析を担当する技術職員の人件費等に使用することを計画している。
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Research Products
(4 results)
