The structure and formation mechanism of the contractile ring by super-resolution imaging

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06253
• Research Institution: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 上条 桂樹 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (10252074)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 細胞質分裂 / アクチン / ミオシン / 収縮環 / 超解像顕微鏡 / Rho

Outline of Annual Research Achievements

動物細胞では，アクチンとミオシンIIで構成される収縮環の収縮により細胞がくびれて細胞質分裂が進行する．収縮環は，染色体の分離後，短時間で形成されるが，形成機構は未解明のままである．
これまでに，超解像顕微鏡（STEDおよびスピニングディスク超解像顕微鏡SpinSR10）を用い，さまざまな細胞質分裂のステージの固定標本およびライブイメージング観察を行った．その結果，染色体が分離すると染色体間の細胞表層の複数のスポットからアクチンフィラメントが放射状に長く伸び，これをミオシンIIが架橋することにより，両フィラメントが赤道面に並行に並び，収縮環が形成されることが示唆された．
そこで，Rhoキナーゼ阻害剤Y27632でミオシンIIの形成を抑制し，固定標本およびライブイメージングでの観察を行った．アクチンフィラメントは染色体間の細胞表層のスポットから長く伸びるものの，赤道面と並行にならなかった．一方，ミオシンATPase阻害剤のBlebbistatinで細胞を処理すると，ミオシンIIは赤道面に形成されて集積するものの，細胞表層のスポットから伸びたアクチンフィラメントは赤道面と並行にならなかった．
アクチンの伸びるスポットの中心には直鎖状アクチンフィラメントの重合を促進するDIAPH3/mDia2が局在する．DIAPH3/mDia2のRNAiを行うと，収縮環のアクチンフィラメントの形成が抑えられる傾向が示された．
これらの結果から，分裂後期に，分離した染色体間の細胞表層でアクチンフィラメントが放射状に伸長し，それを赤道面で新たに形成されたミオシンIIが捕捉して架橋することにより収縮環が形成されることが推定される．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

収縮環の形成に関わる因子を探索するため，RNAiに加えてゲノム編集を行った．通常，ゲノム編集では，ゲノム編集された細胞のクローニングが行われる．しかし，細胞質分裂に必須な遺伝子の場合，細胞増殖が阻害され，クローニングが不可能となることが予想されるため，クローニングを行わない方法を検討した．そこで，Cas9を恒常的に発現するHeLaおよびU2OS細胞にsgRNAを一過性に導入する方法を試みた．Rho調節因子ECT2は収縮環形成に必須で，siRNAによるRNAiでは細胞質分裂が阻害されて多核細胞を生じる．このため，ECT2遺伝子をモデルとしてsgRNAとsiRNAを上記の細胞に導入し比較した．sgRNA，siRNAともに同程度の多核細胞を生じた．しかし，siRNAを導入した細胞の方が早く細胞質分裂の阻害が起こり，収縮環の形成阻害効果も大きかった．これらの違いは，sgRNA，siRNAのトランスフェクション効率の違いによることが考えられる．また，siRNAはmRNAを直接ターゲットとしてDicerが分解するのに対し，ゲノム編集では，DNAの切断によるため，すでに転写されたmRNAを分解することができず，それらが分解されるまで効果が遅れることが考えられる．引き続き，sgRNAのトランスフェクション効率向上方法を検討するとともに，siRNA，sgRNAを適宜利用した細胞質分裂に関わる因子の探索を行う．

Strategy for Future Research Activity

引き続き固定標本およびライブイメージングでの超解像顕微鏡観察で，より詳しく収縮環の構造および形成過程を観察する．画像の取得方法や蛍光色素，蛍光タンパク質の検討で，蛍光強度を高め，より解像度の高い画像を取得して収縮環の構造，形成機構を明らかにする．

sgRNAのトランスフェクションによる一過性ノックアウト系の改良を行い，siRNAによるRNAiと合わせて，低分子量Ｇタンパク質Rhoの下流でアクチンフィラメント，ミオシンII形成に関わる因子の探索を行う．

ミオシンATPase阻害剤Blebbistatinは光毒性があるため，青色の励起光が使えない．このため，Blebbistatinによる細胞質分裂阻害のライブイメージングでは，GFPを用いることができず，mCherryの1チャンネルの観察のみである．近年，Blebbistatinの青色励起で毒性を示さないanalogueの開発されており，これらを用いてアクチンとミオシンIIのミオシンATPase阻害下でのライブイメージング方法を検討し，動態を解明する．

Causes of Carryover

年度末に残額が少額のため翌年度に繰り越す．