2022 Fiscal Year Research-status Report
Establishing the type I CRISPR platform for extra chromosome elimination through epigenetic modulation
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21K06835
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
橋詰 令太郎 三重大学, 医学系研究科, 講師 (50456662)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 光雄 三重大学, 医学系研究科, 講師 (00234097)
脇田 幸子 三重大学, 医学系研究科, 技術員 (20782981)
倉橋 浩樹 藤田医科大学, 医科学研究センター, 教授 (30243215)
北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80506494)
宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 染色体消去 / CRISPR/Cas / トリソミー / Down症候群 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、Down症候群などの過剰染色体を有する核型に対し、染色体消去技術の新規開発を試みるものである。我々研究グループは、トリソミー21のiPS細胞を用いたin vitro実験系において、CRISPR/Cas9による21番染色体単一アレルに対する染色体切断が、標的染色体の細胞からの排除を誘導する知見を得た。さらに、切断箇所数と染色体除去率には正の相関があること、非相同末端結合によるDNA切断後修復機構に関与するLIG4遺伝子や、MMEJに与るPOLQの遺伝子ノックダウンが、染色体除去率の上昇に貢献することを見出した。これらは、CRISPR/Cas9等で染色体切断する際、修復不可能となる確率が上昇し、結果、染色体除去率が向上しているものと思われた。細胞周期依存性であるのか否かは、標的とする細胞によっては重要な問題となりうる。しかしながらいずれにせよ、これらCas9による物理的な染色体切断は、予期せぬ染色体の構造変異を含むゲノム改変のリスクを内包している。
そこで我々は、単一染色体アレル特異的な方法で、II型CEISPR-CasシステムであるCas9とともにI型CRISPRであるCas3システム等を用いた、ゲノム改変を極力抑えたあるいは行わない方法の開発を目指している。II型CRISPR のCas9が1ヶ所のDNA切断を行うのに対し、I型CRISPRであるCas3は、リール状にDNAをたぐり寄せるかたちでDNA上を移動しつつ、シュレッダーのように約100 kbに及ぶ長鎖DNAを一方向性に分解することを特徴としている。本研究では、CRISPR/Cas9で得られている知見・理解を基盤とし、ゲノム改変リスクを最少化する目的でペリセントロメア領域に対する染色体分解や、標的染色体へのエピゲノム修飾によるゲノム改変フリーの染色体消去をCRISPR/Cas3を含めて試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在のところ、CRISPR/Cas3発現ベクターの細胞内導入における一過性発現では、染色体消去率は、CRISPR/Cas9でのdouble strand break (DSB)に比べ、良好な結果を得ていない。CEISPR/Cas3はCas9のような単一タンパク質ではなく、タンパク質複合体であり、したがって発現ベクターとしてのプラスミドのサイズが大きく、細胞内導入がやや困難なことにもまた起因している可能性がある。我々は、薬剤誘導性にCas9およびCas3発現細胞株をゲノム編集により作成した。当初piggyBacによるiPS細胞に対するゲノム内挿入を試みたが、ゲノム内挿入細胞が得られず、MMEJ機構を利用したいわゆるPITCh法にてゲノム編集細胞を作出した。
また、Cas9切断による染色体消去が、細胞周期のどの相でのCas9発現に依存しているかの理解のため、Cas9とgemininあるいはCdt1をCas9のC末に結合した複合タンパク質を発現するベクターを作出した。これらのベクターは順次トリソミー21のiPS細胞に導入され、染色体消去率等が解析中である。さらに、染色体消去により遺伝子シグネチャーが適正化されることを確認する為に、Cas9作動後のトリソミー細胞およびダイソミー細胞株に対し、RNA-seqが行われた。加えて、Cas9によるDSBによるオフターゲット解析ため、Cas9作動後のトリソミー細胞およびダイソミー細胞株数株に対し、次世代シークエンサーによる全ゲノム解析が行われた。
trisomy 21ヒトiPS細胞から各21番染色体を排除した誘導型disomy細胞株の全ゲノムNGS結果をもとに、CRISPR/Casシステムが認識する配列をアレル特異的に抽出した。本成果は、Journal of human geneticsにおいて報告した（PMID: 35637312）。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゲノム編集により作成した薬剤誘導性にCas9およびCas3を発現するトリソミーiPS細胞株等を用いて、ペリセントロメアを含む染色体の異なる部位・領域に対し、エピゲノム修飾を試みる。ペリセントロメア機能は、ヒストンメチル化とDNAメチル化により維持されていることから、エフェクターとして、H3K9脱メチル化酵素や、DNA脱メチル化酵素等を用いることを予定している。これにより標的染色体のみペリセントロメア機能を失わせ、 ゲノム改変を伴わずに染色体の排除をねらう。染色体消去率はこれまでと同様に、FISH法、G分染法、クローニング後のSTR解析等により多面的に評価される。
また、未解決な課題として、細胞周期のどの次期のにおいてCRISPR/Casの発現が、染色体消去につながるのかについての知見が不在ある。この課題についても、Cas発現を細胞周期の各相にあわせて制御する系にて理解することを行う。
興味深い点として、ヌクレアーゼ活性を欠いたdCas9を特定アレルに作用させることにより、DSBを染色体に引き起こさないにもかかわらず、ごく低値であるも、有意差をもってスクランブルgRNAを用いたコントロール群と比し染色体消去率が上昇した結果を得た。ゲノム改変を引き起こさないという点においては、深く追求するべき現象と解するべきであり、ゲノム編集によりdCasシステムを常時発現するトリソミー細胞株を作製し、本現象を追試する予定である。
Cas9による染色体消去の現象に関しては、すでに複数の学会にて成果を報告しているが、本現象に関するデータ・解釈とともに、今年度中に論文として報告する予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度にて予測した、物品費および次世代シークエンサー（NGS）を用いた解析（その他として計上）において、実際の支出よりも予測額が多かったため、次年度使用額が生じた。殊に、NGSを用いた解析が想定よりも実際には少なく、次年度使用額の発生に直結している。今後も、実際の実験の内容や進行に伴い、適宜内訳を調整して、研究経費を最大限有効に活用する予定である。
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