2021 Fiscal Year Research-status Report
Regulation mechanism of host immune response by S100-like proteins from parasite helminths
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21K06996
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
坪川 大悟 北里大学, 医学部, 助教 (30714901)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市川 尊文 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (30245378)
佐藤 雅 北里大学, 医学部, 講師 (40611843)
川上 文貴 北里大学, 医療衛生学部, 講師 (50511896)
川島 麗 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (70392389)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 蠕虫 / RAGE / 宿主応答 / 幼虫体内移行 / S100様分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腹腔内マクロファージや炎症モデルマウスに対する寄生蠕虫S100様分子の機能解析：
終末糖化産物受容体(RAGE)は、哺乳動物の内皮細胞や免疫細胞に発現し、S100蛋白などのダメージ関連分子パターンを認識することで、サイトカインの発現亢進を誘導し炎症反応を引き起こす。これまでに、寄生蠕虫の分泌物質からS100蛋白様分子「Venestatin」を同定し、VenestatinはRAGEに作用するこで炎症応答を抑制することを明らかにした。2021年度は、喘息モデルマウスや腹腔内マクロファージを用いて、炎症応答に対するS100様分子の機能を解析した。
喘息モデルマウス作製のため、野生型とRAGE欠損マウスにHouse dust mite(HDM)抗原を経鼻腔投与した(4回/週・6週)。HDM抗原に加え、組換Venestatin、またはVenestatinカルシウム結合ドメインを含む合成ペプチド(EF peptide)の同時投与群を作製し、肺の病理組織を比較した。野生型とRAGE欠損マウスの腹腔マクロファージをin vitro培養後、RAGEリカンド標品により刺激し、組換VenestatinやEF peptideの添加または未添加の条件下で、炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6)の発現をRT-qPCRにより解析した。
野生型マウスの喘息モデルにおける肺組織では、組換Venestatin やEF peptideにより炎症細胞の浸潤が抑制されたことから、S100様分子のRAGE依存性の炎症抑制効果が示唆された。RAGE欠損マウスに比べ、野生型マウスのマクロファージでは終末糖化産物によるTNF-αやIL-6の有意な発現上昇が確認された。さらに、組換VenestatinやEF peptideの添加によりこれらサイトカイン発現の抑制傾向が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、寄生蠕虫の体内移行に関与する分泌蛋白であるS100様分子の、宿主炎症反応の発端となるシグナルを伝達するパターン認識受容体(PRRs)を介する宿主免疫制御機構を明らかにすることを目的としている。本研究の目的達成のためには、in vitro とin vivo 両実験系からのアプローチが必要となる。2021年度は、野生型マウスとRAGE欠損マウスの腹腔マクロファージを用いたin vitro実験、疾患モデルマウスを用いたin vivo実験を遂行した。その結果、S100様分子「Venestatin」のRAGEシグナルの制御による炎症病態抑制効果を明らかにした。従って、「おおむね順調に進展している」との評価をした。
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| Strategy for Future Research Activity |
①In vivo評価系を用いたS100様分子の機能解明 目標：S100様分子によるPRRsを介するシグナル伝達、下流域エフェクターの動態を明らかにする。
大腸菌、及び蚕発現系により発現したS100様分子と市販のヒト及びマウス組換えPRRs (TLR-4, RAGEなど)の結合親和性について既知リガンドを用いて量的、質的差異の検討を行う。PRRsを発現するマクロファージcell line [RAW264.7 (マウス)、THP-1(ヒト)] とS100様分子を共培養し、IFATやプルダウン法を用い細胞内におけるPRRsとS100様分子の共局在性を調べる。
S100様分子共存下におけるPRRsシグナル経路とエフェクター産生の挙動への影響を量的、質的に解析する。Lipopolysaccharide(LPS: TLR4 リカンド標品)やグリセルアルデヒド(Gla)-BSA(RAGEリカンド標品)を用いて、直接・間接的に発現誘導される遺伝子群、サイトカイン、NF-kBやIRFの核内移行へのS100様分子の作用を明らかにする。
② vivo評価系を用いたS100様分子の機能解明 目標：PRRsリカンド投与による炎症応答や蠕虫感染による2型免疫応答に与える影響など宿主内におけるS100様分子の役割を明らかにする。
目標達成ための基礎実験として、RAGE欠損マウスへのN. brasiliensis感染実験を行う。幼虫をマウスへ投与し、移行時期に沿って肺と小腸を回収し虫体や虫卵を計測する。感染マウスから回収された組織に浸潤する免疫担当細胞の種類や細胞数をフローサイトメトリーにより評価する。組織中や血清中のサイトカインなどエフェクター分子の量的及び局在的挙動を明らかにし免疫応答への影響を調べる。以上より、N. brasiliensisよる2型免疫応答におけるRAGEの役割を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
2021年度は、学会・研究会へのオンライン参加により、予定していた旅費の支出が無くなった。以上の理由から、当初予定していた使用金額よりも少ない支出となった。次年度使用計画については、本研究では、種々の遺伝子及び蛋白解析を日常的に実施することから、試薬類はプライマー作製、抗体、生化学・蛋白質合成試薬などの購入費として予定している。分析キットは迅速に蛋白合成や遺伝子発現を確認でき、すでに標準化されたプロトコールの上で実験が進捗できるキット試薬の購入に充てる。寄生虫の継代や感染実験に用いるラットやマウスの購入費や哺乳細胞や寄生虫の培養に用いる培地と血清の購入費としても計画している。
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