ゴルジ体に潜みがんシグナルを発信する変異RTK ~潜伏機構の解明と新阻害法開発~

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07163
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 小幡 裕希 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (20609408)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 受容体型チロシンキナーゼ / がん / 分子標的薬 / オルガネラ / 細胞内トラフィック

Outline of Annual Research Achievements

これまでに、白血病やGIST等のがん細胞において、KITチロシンキナーゼの恒常的活性化変異体が、特定のオルガネラに停留し、そこから増殖シグナルを発信することを報告した。肺腺がんや骨髄腫等の他のがんのキナーゼ変異体もオルガネラに停留していることを見出しており、局在異常が増殖シグナル発信の原因の一つであることを示唆するデータが得られている。本課題では、変異チロシンキナーゼのオルガネラ停留の原因となる分子メカニズムの解明に取り組んだ。
予備的なスクリーニングにより、特定分子Aが、GISTのKIT変異体のゴルジ体停留に必須であることを示唆するデータが得られており、本年度は、その結果を、複数のインヒビターおよびsiRNA/shRNAによって確認し、共免疫沈降法, in vitro pulldown assay, proximity ligation assay (PLA法) などによる物理的相互作用の解析を計画した。分子AをインヒビターやsiRNAで機能阻害すると、GISTのKIT変異体は、ゴルジ領域に滞留することができなくなった。さらに、KITは、分子Aと共沈降し、PLA法により、ゴルジ領域で相互作用することが明らかになった。即ち、GISTのKIT変異体は、分子Aと相互作用することで、ゴルジ領域に停留することが示唆される。次年度は、他のがんの変異チロシンキナーゼと分子Aの関係についての解析と、分子Aの上流およびエフェクターの解明をおこなう予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初めて使用するインヒビターについて、濃度と時間の設定, 選択性の確認などをスムーズに進めることができた。GIST細胞株の遺伝子導入効率は低く、siRNAのトランスフェクションの段階で、躓く可能性があったが、至適条件を見出すことができた。タンパク質間相互作用についても、複数のアプローチにより、お互いの結果を支持し合うデータが得られた。

Strategy for Future Research Activity

本年度で得られた結果が、GISTのKIT以外にも適用可能かどうかを検討する。具体的には、変異チロシンキナーゼがゴルジ体に停留している急性骨髄性白血病や、多発性骨髄腫における解析をおこなう。さらに、分子Aの上流とエフェクターについて、明らかにする目的で、候補分子のノックダウンを試み、フェノコピーを探索する。フェノコピーを見出したら、候補タンパク質が分子Aと物理的相互作用するかどうかを検討する。

Causes of Carryover

新たに幾つかのノックダウンの実験が必要になり、それが次年度の実施となったため。その結果を確認してから共免疫沈降法に使用する抗体を決定するため、次年度使用額が生じた。

Research Products

• [Journal Article] FLT3-ITD transduces autonomous growth signals during its biosynthetic trafficking in acute myelogenous leukemia cells (2021)
  • Author(s): Yamawaki K, Shiina I, Murata T, Tateyama S, Maekawa Y, Niwa M, Shimonaka M, Okamoto K, Suzuki T, Nishida T, Abe R, Obata Y.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Pages: 22678
  • DOI: 10.1038/s41598-021-02221-2.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Stemness and immune evasion conferred by the TDO2-AHR pathway are associated with liver metastasis of colon cancer (2021)
  • Author(s): Miyazaki T, Chung S, Sakai H, Ohata H, Obata Y, Shiokawa D, Mizoguchi Y, Kubo T, Ichikawa H, Taniguchi H, Aoki K, Soga T, Nakagama H, Okamoto K.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 113 Pages: 170-181
  • DOI: 10.1111/cas.15182.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research