2021 Fiscal Year Research-status Report
フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞の１粒子解析
| Project/Area Number |
21K07173
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
吉田 孟史 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (60635100)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 細胞外小胞 / フローサイトメトリー / リキッドバイオプシー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
生体内のほとんどの細胞が分泌する直径30-150 nmの細胞外小胞（small extracellular vesicles; sEV）は、がんや神経変性疾患など様々な疾患に関与していることが明らかとなりつつある。しかしながら、非常に小さな粒子であるsEVを１粒子レベルで検出・解析することは困難であり、疾患診断への応用や基礎研究の発展が遅れている。本研究では、独自の高感度sEV検出技術を利用することでフローサイトメーターを用いたsEV表面タンパク質、脂質、sEV内包microRNA解析技術の確立を目指している。将来的には、高感度ながん診断法の開発やsEVを利用した創薬開発の技術支援への貢献が期待される。これまでに、１粒子解析が可能であるかの検証と定性解析法の確立について実施した。前者は、２種類の蛍光タンパク発現sEV（CD63GFP-sEVおよびCD63BFP-sEV）識別することで検証した。２種類のsEVを任意の比率で混合した試料をフローサイトメータで測定し、それぞれのsEVを区別して検出可能な解析条件を確立した。後者は、基本的なsEVマーカーであるCD9、CD63, CD81とsEV膜の主要脂質成分であるホスファチジルセリン（PS）の染色条件を検討した。蛍光色素の検討では蛍光強度の高いPE、PE/Cy7などの色素が適していることを明らかにした。また、抗体染色後の洗浄が非常に重要であることが明らかとなり、sEVを磁気ビーズで捕捉することで効率よく洗浄可能な手法を確立した。PSの染色はPS結合タンパク質であるAnnexin VやMFG-E8などを用いることで染色可能であることを明らかとした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度は「１粒子解析が可能であるかの検証」、「定性解析法の確立 タンパク質染色法の確立」および「定性解析法の確立 脂質染色法の確立」を予定していた。当初の予定通り１粒子解析が可能であるかの検証と定性解析法の確立について実施し、期待していた研究成果が得られた。また、2022年度に予定している「定量解析法の確立」および「多様な培養細胞由来sEVの解析」についての予備検討に着手している。以上のことから順調に進展していると評価した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2022年度はsEVの内包物に対する染色法の確立、sEVの定量解析法の確立、多様な培養細胞由来sEVの解析を目指す。sEVの内包物に対する染色法の確立では、様々な疾患に関わることが報告されているmicro RNAに焦点を当て、膜透過処理、蛍光色素、染色時間、洗浄方法の最適化を行う予定である。sEVの定量解析法の確立では、細胞培養上清中のsEV粒子数濃度をフローサイトメーターで定量することを目指す。具体的には、sEV試料に濃度既知の蛍光標識スタンダードビーズを内部標準物質として添加し、試料に含まれるsEVの粒子数濃度の定量解析法を確立する。多様な培養細胞由来sEVの解析では、悪性度の異なる２種類のヒト骨肉腫細胞株（HOS細胞、143B細胞）を用いて、悪性度によるsEVの質的な違いの解析を目指す。
|
| Causes of Carryover |
コロナの影響により参加予定学会がオンライン開催となり旅費100,000円が不要となった。また、研究が予定より若干進展しているため物品費が29,340円の増加となった。
|
