2021 Fiscal Year Research-status Report
新規リソソーム分布制御機構に着目したPD治療薬の探索
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21K07425
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
笹澤 有紀子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (20594922)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リソソーム / オートファジー / パーキンソン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はパーキンソン病の分子病態解明のためにメタボロームを実施し、ポリアミン代謝変動 (Ann Neurol, 2019)、および、その過程で生じる毒性アルデヒドの上昇を明らかにした。このアルデヒドはタンパク質Xのリン酸化を介する新規分子機構によってリソソーム分布をMTOC周辺に変化させ、オートファジーを引き起すことを見出した。今年度は、タンパク質Xのリン酸化部位の同定を行った。まず、Flagタグ-タンパク質X過剰発現細胞を樹立し、アルデヒド添加時およびアルデヒドとKinase阻害剤添加時のlysateを回収、Flagアフィニティービーズを用いて精製した。SWATH-MSを用いてリン酸化ペプチドの解析を行い、アルデヒドによるタンパク質Xのリン酸化部位を同定した。さらに、CRISPR-Cas9 systemを用いて、タンパク質Xのノックアウト細胞を樹立した。この、タンパク質Xノックアウト細胞では通常培養条件でリソソームは細胞の辺縁部に多く存在しており、アルデヒドによるリソソーム分布変化は誘導されなかったが、タンパク質Xノックアウト細胞にFlagタグ-タンパク質Xを発現させると、アルデヒドによりリソソーム分布が変化した。一方、リン酸化部位をAlanineに置換したタンパク質X変異体を発現させるとリソソーム分布が変化は起こらなかった。このことから、アルデヒドはタンパク質Xのリン酸化を介してリソソーム分布を変化させていることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、アルデヒドによって誘導されるタンパク質Xのリン酸化部位を同定することに成功し、リン酸化部位の変異体を用いたresucue実験で同定したリン酸化部位がリソソーム分布変化に必要であることが明らかとなったため、順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、タンパク質Xと相互作用する分子を同定し、アルデヒドによるリソソーム分布制御機構の全貌に迫る。また、同定したシグナルを調節する毒性のないリソソーム分布制御剤をスクリーニングにより同定する予定である。
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| Causes of Carryover |
研究が思わぬ進展をしたため、当初2021年度に予定していたsiRNAを用いた実験を2022年度に変更していた。そのため、2022年度にsiRNA購入費として使用予定である。
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