Elucidation of irreversible switch mechanism in hepatic stellate cell activation

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07968
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 松原 三佐子 (佐藤三佐子) 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 特任講師 (00635120)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 勤 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 肝星細胞 / 肝細胞 / 線維化 / 肝発がん / サイトグロビン / 細胞間相互作用 / ミトコンドリア呼吸鎖

Outline of Annual Research Achievements

肝発がん当初から線維化を形成する活性化した肝星細胞（Hepatic stellate cell, HSC）と肝細胞間には相互作用があり肝細胞のがん化や成長に関係する事が推測されるがその直接的証拠はない。私が所属した研究室（大阪市立大学、肝胆膵病態内科）において、肝ではHSCsのみに発現するグロビン蛋白質の一つであるCytoglobin（CYGB）が発見され、 グロビンに共通の蛋白機能が解明された。同時に、Cygb欠損マウスを用いた数種のin vivo肝障害モデルによりHSCsにおけるCYGB欠損が肝炎症・線維化反応を増強させ、延いては肝発がんを促進することが証明された。CYGBはHSCs活性化の鍵因子であり、その欠損は活性酸素や生理活性因子、細胞外マトリックスの過剰産生を惹起した。これまでの成果を基にHSCsにおけるCYGBの発現調節機構を詳細に解析すると同時に、本研究では、HSC活性化が持続的かつ不可逆的になるHSC活性化スイッチ機構が存在し、それが肝硬変の難治性に繋がっていると考え、CYGB-HSC軸が隣接する肝細胞のDNA損傷を通じた発がんにどのように寄与するかについて解明する研究に着手した。HSCsのCYGB発現がヒドロキシ（・OH）ラジカル消去に関わり、その欠損がDNA酸化障害を助長したことを見出した。さらに、ヒトアルコール脂肪性肝炎において、HSCのCYGBの発現減少がDNA損傷と負の相関を示すことを明らかにした。この結果を基に、マウスHSCのCygbが欠損したノックアウト（KO）の肝臓からミトコンドリアを採取・精製し、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素活性の測定を行い肝細胞とHSCの相互作用をさらに解明すべく研究を継続している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目的通り（a)DNA損傷関連因子であるPARP１に着目し、TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞（CYGB低発現）のDNAを採取し、ChIP- Sequecing用のDNAのSonicationおよびLibrary作製を行った。さらに、（b）Cygb欠損マウスの肝臓よりミトコンドリアを採取・精製し、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素活性を測定した。さらに、(c)肝細胞とHSCの共培養実験を行い、HSC-Cygb欠損による肝細胞への影響を調べた（ｂ）に関しては当初の計画以上の進展している。

Strategy for Future Research Activity

今年度、1）CYGB発現を調整したHSCsとHepG2細胞との共培養：共培養により肝細胞側の酸化ストレスマーカー4-HNE、8-OHdG発現による酸化的DNA損傷の有無、γH2AX発現 によるDNA double-strand break の有無を検討する。この場合、TGF-βをはじめとする発がん関連因子（成長因子、サイトカイン、ケモカイン等）やH2O2の存在で反応が加速されるか検討する。 (2) CYGBが低発現した場合に肝細胞DNA障害が生じると推測している。その機序について、 TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞（CYGB低発現）のDNAに対し、PARP１抗体を用いたChIP-Sequencingの解析を継続し、PARP1標的部位の同定を行う。（3）Cygb KOマウスの肝臓から採取したミトコンドリア呼吸鎖の酵素活性を調べた研究をまとめ報告する。

Causes of Carryover

今年度、概ね順調に研究が進んだ。そのため、論文投稿準備の予算分を次年度に残すことにした。

Research Products

• [Journal Article] Capacity of extracellular globins to reduce liver fibrosis via scavenging reactive oxygen species and promoting MMP-1 secretion (2022)
  • Author(s): Hieu VN, Thuy LTT, Hai H, Dat NQ, Hoang DV, Hanh NV, Phuong DM, Hoang TH, Sawai H, Yoshitsugu S, Sato-Matsubara M, Oikawa D, Tokunaga F, Yoshizato K, Kawada N
  • Journal Title: Redox Biology Volume: 52 Pages: 102286
  • DOI: 10.1016/j.redox.2022.102286
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Stress can attenuate hepatic lipid accumulation via elevation of hepatic β-muricholic acid levels in mice with nonalcoholic steatohepatitis. (2021)
  • Author(s): Takada S, Matsubara T*, Fujii H, Sato-Matsubara M, Daikoku A, Odagiri N, Amano-Teranishi Y, Kawada N, Ikeda K.
  • Journal Title: Lab Invest. Volume: 101 Pages: 193-203
  • DOI: 10.1038/s41374-020-00509-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hexa Histidine-Tagged Recombinant Human Cytoglobin Deactivates Hepatic Stellate Cells and Inhibits Liver Fibrosis by Scavenging Reactive Oxygen Species (2021)
  • Author(s): Dat, NQ, Thuy LTT, Hieu VN, Hai H, Hoang DV, Hai NTT, Thuy TTV, Komiya T, Rombouts K, Dong MP, Hanh NV, Hoang TH, Sato-Matsubara M, Daikoku A, Kadono C, Oikawa D, Yoshizato K, Tokunaga F, Pinzani M, Kawada N*.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 73 Pages: 2527-2545
  • DOI: 10.1002/hep.31752
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anti-fibrotic treatments for chronic liver diseases: The present and the future (2021)
  • Author(s): Odagiri N, Matsubara T, Sato-Matsubara M, Fujii H, Enomoto M, Kawada N
  • Journal Title: Clin Mol Hepatol. Volume: 27 Pages: 413-424
  • DOI: 10.3350/cmh.2020.0187
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 肝細胞と肝星細胞との細胞膜を介した直接的なクロストーク (2021)
  • Author(s): 井上喜来々、松原三佐子、Truong Huu Hoang、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 肝細胞研究会
• [Presentation] 臨床検体から抽出した癌抑制遺伝子SKIによる肝胆癌細胞周期の抑制 (2021)
  • Author(s): 川村悦史、松原勉、大黒敦子、武藤芳美、高田さゆり、新川寛二、木下正彦、小田桐直志、小谷晃平、元山宏行、小塚立蔵、松原三佐子、萩原淳司、藤井英樹、打田佐和子、田中肖吾、竹村茂一、榎本大、田守昭博、久保正二、池田一雄、河田則文
  • Organizer: 第44回 日本肝臓学会西部会
• [Presentation] Cytoglobin欠損マウスの肝星細胞に由来する一酸化窒素は肝細胞のミトコンドリア機能障害を引き起こす (2021)
  • Author(s): 翁良徳、松原三佐子、宇留島隼人、松原勤、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 第35回 肝類洞壁細胞研究会
• [Presentation] Intracellular gap formation of the liver sinusoidal endothelial cells facilitates the liver metastasis ability of cancer cell (2021)
  • Author(s): Truong Huu Hoang, Misako Sato-Matsubara, Yuasa Hideto, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Le Thi Thanh Thuy, Atsuko Daikoku, Yoshinori Okina, Akihiro Tamori, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cell membrane-mediated direct crosstalks between hepatocytes and HSCs (2021)
  • Author(s): Kirara Inoue, Misako Sato-Matsubara, Truong Huu Hoang, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Atsuko Daikoku, Kazuo Ikeda, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: Asian Pacific Association for the Study of the Liver (APASL) Single Topic Conference 2021 Osaka
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Intracellular gap formation of the liver sinusoidal endothelial cells facilitates the liver metastasis ability of cancer cells (2021)
  • Author(s): Truong Huu Hoang, Misako Sato-Matsubara, Yuasa Hideto, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Le Thi Thanh Thuy, Atsuko Daikoku, Yoshinori Okina, Akihiro Tamori, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) The Liver Meeting 2021
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 大阪公立大学大学院医学研究科肝胆膵病態な化学
  • URL: http://www.med.osaka-cu.ac.jp/liver/