2022 Fiscal Year Research-status Report
ピロリ菌感染および未感染胃癌の発症機序解明に向けたトランスオミクス解析
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21K08010
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
松本 昂 大分大学, 医学部, 助教 (50609667)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塚本 善之 大分大学, 医学部, 助教 (00433053)
山岡 吉生 大分大学, 医学部, 教授 (00544248)
赤田 純子 大分大学, 医学部, 助教 (30346548)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ピロリ菌感染症 / 次世代シーケンス / 胃癌 / 胃オルガノイド / RNA-Seq / メタボロミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ピロリ菌感染症および関連疾患と胃細菌叢との関連性を明らかにするため、モンゴルを含むアジア地域から収集された胃粘膜上皮生検におけるマイクロバイオーム解析を実施した。特に、モンゴルにおいて確認された、ピロリ菌未感染胃癌患者におけるEnterococcus（Ent）の増殖が原因と考えられるdysbiosisの原因を探るため、本菌を分離培養し、次世代シーケンスにより全ゲノム配列決定し、主要病原因子について検索した。ピロリ菌の新たな病原因子の検索に向け、ピロリ菌株のメタボローム解析およびRNA Seqを実施し、現在解析中である。また、Entまたはピロリ菌感染による新たな発がん機序を探るため、AGS細胞株、さらに、昨年度までに樹立した幽門部上皮細胞由来の胃オルガノイドを用いて感染実験を実施した。Entまたはピロリ菌感染に起因するゲノムの不安定性を評価するため、Comet AssayによるDNA二本鎖切断（double-strand break: DSB）の観察、加えて、WBによりDSBの特徴であるリン酸化H2AX発現を評価した。Entおよびピロリ菌感染に伴う細胞の形態学的変化、ROS産生、DSBを確認することができた。次に、トランスウェルを用いて、菌と細胞との接着を遮断し、この病原因子が接着に起因するものかどうかを評価した。その結果、ピロリ菌では、細胞接着によってのみDSBが確認され、一方、Entは、細胞上清中に分泌される細胞外毒素がDSBに関与していることが明らかとなった。加えて、感染時における2次元幽門部胃オルガノイドの組織学的変化をHE染色、MUC5ACおよびMUC6の局在、さらに、30K遺伝子をターゲットにしたmRNAマイクロアレイを実施した。
上記研究成果をまとめ、2023年5月に米国で開催されるDigestive Disease Week 2023にて発表予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
各国の胃マイクロバイオーム解析について当初計画通り進捗しており、現在、解析データをまとめている。ピロリ菌およびEntの全ゲノム配列も決定されており、主要病原因子を検索・評価できている。加えて、予備試験的にピロリ菌の病原因子欠損株におけるRNA-SeqやCapillary Electrophoresis Fourier Transform Mass Spectrometry（CE-FTMS）を用いたメタボローム解析を実施しており、新たな研究シーズの発掘も期待できる。
in vitro実験系においても、AGS細胞株（胃腺がん）およびMKN45（低分化型腺がん由来）、MKN28 およびMKN74細胞株（中分化型腺がん由来）の複数の細胞株を用いて、感染時のROS産生やDSBの条件検討が完了し、評価系が確立できており、2次元幽門部胃オルガノイドを用いた組織学的評価も実施可能である。加えて、胃オルガノイドにおける感染時のインフラマソームの挙動を評価するため、mRNAマイクロアレイを実施しており、当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ピロリ菌およびEntによる共感染モデルによるDSB誘導に関する研究成果をまとめ、学術雑誌への投稿準備を進める。ピロリ菌のゲノム解析から明らかになった病原遺伝子Aについて、遺伝子欠損株を作成し、RNA-Seq解析を実施した。これら結果から、本病原因子がピロリ菌のトランスクリプトームへ与える影響について明らかにする予定である。また、本菌のメタボローム解析について一定の解析結果が得られているものの、安定的な代謝物質の回収プロトコルの確立、より目的の代謝物質のターゲットを絞ったCE-TOFMSによる解析を中心にn数を確保し、データを補完する必要がある。一方、胃オルガノイドにおけるメタボローム解析に向けて、マトリゲルの存在を考慮した、条件検討が必要であるが、RNA-Seqによる解析法が確立できれば、代替案として検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
他予算から本年度使用予定の一部試薬について支出が可能であった。また、翌年度に追加で実施する計画であるRNA-Seqおよびメタボローム解析の予算として確保する必要があり、当該予算を繰り越した。
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[Presentation] Mutations Related to Antibiotics Resistance in Helicobacter pylori Clinical Isolates from Bangladesh.2023
Author(s)
Fauzia, Kartika Afrida, Hafeza Aftab, Evariste Tshibangu-Kabamba, Ricky Indra Alfaray, Batsaikhan Saruuljavkhlan, Alain Cimuanga-Mukanya, Takashi Matsumoto, Phawinee Subsomwong, Junko Akada, Muhammad Miftahussurur, and Yoshio Yamaoka
Organizer
International Symposium on Helicobacter and Upper Gastrointestinal Disease
Int'l Joint Research
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[Presentation] Outer membrane protein HopF is involved in biofilm formation and virulence in Helicobacter pylori.2023
Author(s)
Kartika Afrida Fauzia, Yuri Sugawara, Mayu Obata, Rizki Amalia, Ricky Indra Alfaray, Camilia Metadea, Junko Akada, Takashi Matsumoto, Muhammad Miftahussurur, Yoshio Yamaoka
Organizer
The 19th Korea-Japan H. pylori Joint Symposium, Gut and liver
Int'l Joint Research
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