自己細胞を用いた気管の再生

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08892
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 小島 宏司 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 准教授 (40288155)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸島 秀樹 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (30338941) ; 木村 祐之 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (50740859)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: バイオ気管 / 気管再生 / 軟骨培養 / 気道再建 / 生分解性ポリマー

Outline of Annual Research Achievements

2018年から3年間の科学研究費助成下での研究実績の概要は、①80歳以上の患者から採取した気管支軟骨からでも軟骨細胞の培養が可能となり、培養期間を増やすことなく2回の継代でバイオ軟骨を作製することが可能となった。また、ヌードマウスの背部皮下に埋植した、PGA/細胞マトリックスからバイオ軟骨を作製できた。②イヌより採取した気管軟骨より、軟骨細胞培養が可能な培養条件を検討した。その結果、気管軟骨をコラーゲンIIで37度下、8－12時間digestionすることにより軟骨細胞を獲得できた。
本研究においては、2021年4月よりイヌ(N=2)を用いて、頸部気管より軟骨を２リング採取し、前回の助成で確立した条件で軟骨細胞を培養した。しかし、細胞数が増加しなかったり、培養中に細胞形態が変化し理想的な軟骨細胞が安定して得られななかった。ヒト、ヒツジ軟骨細胞と比べると明らかに培養軟骨細胞の育ちが悪かった。そこで、他の実験で犠牲死させたウサギを用いることを検討した。2021年10月よりウサギの頸部気管から軟骨を採取し軟骨細胞の培養を開始した。イヌと比較し、安定して軟骨細胞が得られ、2回の継代においても細胞の形態は変化しなかった。生分解性ポリマー（PGA)に塗布して、ヌードマウスの背部皮下に埋植した。ヒツジやヒトと同様の硬い白色のバイオ軟骨が作製できた。本研究は自己細胞を用いた気管の再生の研究である、当初、イヌを用いた実験計画であったのは気管のサイズがヒトを同じであること、気管の吻合が手術手技上やりやすいことであったが、イヌからの軟骨細胞が安定して得られないため実験動物の変更を決断した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度はイヌ(N=2)の頸部気管より軟骨を採取し、軟骨細胞を培養したが、細胞数が増加しなかったり、培養中に細胞形態が変化し理想的な軟骨細胞が安定して得られなかった。継代を2回まで試みるも、継代2回めのイヌの軟骨細胞は形態を失い安定した細胞数が得られなかった。軟骨組織をコラーゲンで酵素処理する際に問題がある可能性も否定できないため、他の２種類のコラーゲンを試みたが、軟骨細胞は採取できたが安定して培養できなかった。このまま、残りの2年間を犬を用いて研究することは、動物尊厳の観点や時間を考えると実験動物を変更するのが正しいと判断した。当教室では、ウサギの気道狭窄モデルの研究も行っているため、犠牲死させたウサギより気管軟骨より軟骨細胞が採取できるかの予備実験を行なってみた。その結果、ウサギの気管から6時間くらいのコラーゲンによる酵素処理をすることによって容易に軟骨細胞を採取することが確認できた。そこで、2022年1月よりウサギの気管より採取した軟骨から軟骨細胞を培養し、生分解性ポリマー（PGA)に塗布して、ヌードマウスの背部皮下に移植を試みた結果、硬い白色の軟骨を作製できた。次年度からは、ウサギを用いた気管再生の研究をすることとした。

Strategy for Future Research Activity

本研究の次年度からは、イヌの代わりにウサギを用いた再生気管の作製を開始する。すでに初年度で、ウサギから採取した培養軟骨細胞で、ヌードマウスの背部皮下に埋植したPGAシートと軟骨細胞マトリックスが、白色で硬いバイオ軟骨の作製に成功しているため、正常のウサギの気管と比較するため免疫組織学的染色、生化学検査を行う予定である。また、ビーグル犬の実験モデルと同様に、ウサギの頸部皮下に埋植して再生気管を作製する。ウサギの頸部気管のサイズを測定し、自作シリコンステントの作製や、培養した軟骨細胞をPGAシートに塗布し、ウサギの頸部気管の横に埋植する。
予備実験としてウサギの気管切除を施行した際、気管の端々吻合が手技上可能なのかを検証する必要がある。
ウサギの筋肉内に投与する免疫抑制剤の量も検討する。

Causes of Carryover

初年度はイヌを用いた実験を２頭行ったが、安定した軟骨細胞が得られなかったため、2021年10月にイヌからの採取を断念し、ウサギの頸部気管より軟骨細胞を採取して培養軟骨細胞を獲得することとした。ウサギは必要最小限の2羽で実験をし、研究費の節約に努めた。その結果、次年度への研究使用額が生じた。次年度の使用計画は、ウサギを４羽ずつ増やし、まずはウサギの頸部気管において気管の端々吻合が可能かを２羽を用いて検討する。手技上は他実験で犠牲死させたウサギの頸部気管を用いて可能であると確認してある。実際に吻合後のエアリークがなければ、ウサギを用いた実験へ移行可能である。このことは2022年7月までに検討する。その後は、イヌで計画された実験計画書に準じて研究を続行する。