2021 Fiscal Year Research-status Report

Development of innovative treatment for spinal cord injury using next-generation exosomes

Research Project

Project/Area Number	21K09231
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	廣田亮介札幌医科大学, 医学部, 助教 (10815434)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福士龍之介札幌医科大学, 医学部, 研究員 (00894065) 佐々木祐典札幌医科大学, 医学部, 准教授 (20538136) 栗原康太札幌医科大学, 医学部, 研究員 (20855803) 山下敏彦札幌医科大学, 医学部, 教授 (70244366) 本望修札幌医科大学, 医学部, 教授 (90285007) 小原尚札幌医科大学, 医学部, 研究員 (20919732)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	脊髄損傷 / エクソソーム / AAV-CAG
Outline of Annual Research Achievements	脊髄損傷に対するBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム (BDNF-MSCexo)単独の治療効果の検証と、MSCとBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム (BDNF-MSCexo)の併用療法の治療効果を検証を行っている。本研究では、ラット用脊髄損傷作成装置(IH-0400 Impactor; PSI社製)を用いて、SDラットのTh9レベルに実験的SCI(脊髄損傷)を作製し、(遺伝子改変は脳由来神経栄養因子 (Brain derived neurotrophic factor: BDNF)を過剰発現するBDNF-MSCを用いている。実験1：MSC由来エクソソーム (MSC exo)とBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム(BDNF-MSCexo)による治療効果の比較解析実験群1：SCI + MSCexo (DMEM 1.0ml)　実験群2：SCI + BDNF- MSCexo (DMEM 1.0ml) 解析方法として ①生化学的解析：投与前に、in vitroにおいて、MSCexo とBDNF-MSCexo 中に含まれるBDNFをELISA (BDNF E-max immunoassay system, Promega) 法で定量した。さらに、各実験群の動物の脊髄損傷周囲におけるin vivoにおけるBDNFを定量解析した。 ② 神経解剖学的解析代表的な脳脊髄神経回路である皮質脊髄路・網様体脊髄路・赤核脊髄路を用いて解析した。観察期間終了後（受傷29日後）に全身麻酔下に定位的に、AAV-CAG-GFPまたはAAV-CAG-Tdtomatoを脳の各神経回路のoriginまたは脊髄に微量インジェクション機器を用いて選択的に注入し、その後6週の待機期間を経て再構築される神経回路の解析を行った(Neurolucida、 MBF社、IMARIS, Zeiss社)。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 現時点で実験群の比較解析により、MSC exoとBDNF-MSCexoの治療効果の検証が行えており進捗状況は順調であると考える。
Strategy for Future Research Activity	今後の計画として、計画2：MSC併用下におけるMSC exoとBDNF-MSCexoの治療効果の比較解析実験群3：SCI + MSC (1.0x106cells/DMEM 0.5ml) + MSCexo (DMEM 0.5ml)　実験群4：SCI + MSC (1.0x106cells/DMEM 0.5ml) + BDNF-MSCexo (DMEM 0.5ml) これらの実験群の比較解析を行うことで、MSC治療併用下におけるMSC exoとBDNF-MSCexoの治療効果の検証が可能であり、実臨床への展開に即した検証となる。計画3：BDNF-MSC使用下におけるBDNF-MSCexoの治療効果の解析　実験群5：SCI +BDNF-MSC (1.0x106cells/DMEM/0.5ml) +BDNF- MSCexo (DMEM/0.5ml)を、計画2の結果と比較解析することにより、最も治療効果の高い次世代型エクソソームを用いた細胞療法の確立を目指す。以上の実験計画を2022年度に行う予定を立てている。
Causes of Carryover	今年度は神経トレーシングに必要なウイルスベクターの購入費用が予想よりも安価であったため、次年度使用額が生じた。次年度はBDNF-MSCexoのmiRNA解析から、次世代シーケンサーmiRNAライブラリーの構築を積極的に行う予定である。