2021 Fiscal Year Research-status Report
The study of the normal regulatory mechanism in the alveolar bone by PDPN-dependent mechanosensing
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21K10153
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
金井 壮律 北海道大学, 歯学研究院, 助教 (20344517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 嘉晃 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (00250465)
沢 禎彦 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (70271666)
足利 雄一 北海道大学, 大学病院, 講師 (70372258)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 矯正学的機械的ストレス / ポドプラニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
矯正学的機械的（メカニカル）ストレス環境にある顎骨において、メカニカルストレスを骨リモデリングにトランスダクションする骨細胞の決定的分子は未解決である。代表者らはメカニカルストレスが骨細胞のポドプラニンpodoplanin産生と石灰化を促進し、この石灰化がpodoplanin特異抗体およびpodoplanin受容体である血小板CLEC-2で強力に阻害されることを報告した。また、podoplanin遺伝子Pdpn をコンディショナルにノックアウト (cKO) したマウスWnt1-Cre;PdpnΔ/Δでは矯正学的メカニカルストレスを負荷した顎骨で破骨細胞の集積が見られないことを見出し、podoplaninが骨細胞のメカノトランスダクションを仲介して石灰化に関与すると着想した。本研究は、骨細胞のpodoplaninを介するメカノトランスダクションの分子経路を、Pdpn cKOマウスと培養Pdpn cKO骨細胞、および矯正学的メカニカルストレス実験を応用して可視化することを目的とする。具体的には、矯正学的メカニカルストレスがPdpn cKOマウス顎骨の骨細胞の石灰化物産生と骨リモデリングを促進せず、歯牙移動が急速に起こること、またメカニカルストレスが培養骨芽細胞の石灰化物産生を促進することからメカニカルストレス誘導性のRhoA-ERM-MLCアッセンブリー形成、骨関連タンパク産生の細胞内伝達経路の活性化と石灰化物産生が、培養Pdpn cKO骨細胞では起こらないこと、さらに、CLEC-2陽性マクロファージ系細胞・破骨細胞のpodoplanin陽性骨細胞との接触が骨細胞に突起の収縮、骨芽細胞への幼若化あるいは細胞死による石灰化能の低下をもたらし、Pdpn cKO骨細胞ではそれが起こらないことを示す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Wnt1-Cre;PdpnΔ/Δ(顎骨Pdpn cKO)マウス由来の培養細胞を用いた石灰化抑制の検討として以下の実験を行っている。
形態解析：川本法で切片を作製、Ⅰ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチンおよびアルカリフォスファターゼ等の骨関連蛋白の免疫・酵素組織化学的染色を行い、染色領域のスキャンとImageJによる面積定量によって骨関連蛋白の形成を評価。
元素分析：X線回折にて骨における元素成分含有量を定量を行い、骨成分を溶解し、ELISA・ウエスタンブロットにて骨関連蛋白の生化学的分析。
タンパク・遺伝子解析：粉砕骨組織・培養細胞からトータルRNA・タンパクを採取、リアルタイムPCR・ウェスタンブロット・ELISAにて骨関連蛋白のmRNA発現の定量。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vitro 実験が終われば in vivo 実験に移行して行く。
Wnt1-Cre;PdpnΔ/Δ(顎骨Pdpn cKO)マウス、野生型マウスおよび卵巣摘出による骨粗鬆症マウス顎骨の第１臼歯抜歯窩にCLEC-2(RSD社)含有アテロコラーゲンデリバリーを填入、骨再生抑制の可視化を行う。また、メカニカルストレス実験として、上記のマウスの上顎両側第1・第2臼歯間に種々のゴム厚のゴム片を挿入（Waldo法）、経過をマイクロ CT にて観察する。至適ゴム厚と挿入期間を決定する。
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| Causes of Carryover |
残金が少額で購入できる物品がなかったため次年度に繰り越した。
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