近位ビオチンラベル法を用いた核内構造体の動作機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15012
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 栗原 美寿々 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (40763074)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 非膜オルガネラ / 近位ビオチンラベル

Outline of Annual Research Achievements

近年、特定の立体構造を取らないタンパク質の天然変性ドメインが、微弱な分子間相互作用によって、核小体やPML bodyをはじめとした「非膜オルガネラ」の形成を制御しているのではないかという考え方が大きな注目を浴びている。非膜オルガネラの形成機構に関する情報が急速に蓄積しつつある一方で、これらの非膜オルガネラがどのようにしてその分子機能を発揮しているのかについての情報は、実は非常に限られているのが現状である。その大きな理由の一つが、天然変性ドメインが仲介する一つ一つの相互作用があまりにも微弱であるために、古典的な免疫沈降や生化学的な複合体精製などの手法ではその相互作用の対象となる分子の全容を明らかにすることができなかったという技術的な限界が挙げられる。本研究では、微弱かつ一過的な分子間相互作用でも高感度で検出することが可能な近位ビオチンラベル法を用い、代表的な非膜オルガネラであるPML bodyやカハールボディ、パラスペックルと相互作用する分子を明らかにする。本研究によって、従来の手法では解明できなかった非膜オルガネラの分子機能、さらにはタンパク質の天然変性ドメインの動作機構を明らかにすることができると期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はPML bodyを構成する分子を同定するため、APEXをPML遺伝子座に挿入したマウスES細胞を用いて、PMLタンパク質と相互作用する分子をビオチン標識し、網羅的に同定した。同定された分子の中には、PML bodyの構成因子として既に報告されている分子も含まれており、概ね順調に解析が進んでいると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

PMLタンパク質の一部はPML bodyではなく、核質に局在することが知られている。従って、PML bodyを構成するPMLタンパク質と相互作用する分子をより詳細に同定するため、PML変異体(PML　bodyを構成できない)にAPEXを付けた融合タンパク質を発現する細胞を作成し、相互作用する分子を同定する。