網羅的タンパク質解析を用いた心停止/心停止後症候群に関わる新規物質の発見

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16584
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 今枝 太郎 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (30598230)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 心停止後 / 心停止後症候群 / 神経学的予後予測

Outline of Annual Research Achievements

心停止患者に対する治療は近年進歩しており，ECPR（extracorporeal cardiopulmonary resuscitation:人工心肺補助装置を用いた蘇生術）や脳低温療法を含む包括的な集中治療が，心停止患者の転帰改善に寄与しているとして注目されている．
費用対効果や倫理的側面を考慮し，人工心肺補助装置の使用や脳低温療法などの高価な治療の適応を的確に判断する早期の神経学的予後予測の重要性が高まってきており，画像検査や電気生理学的検査とともに新たなバイオマーカーの探索が必要とされている．
今回，心停止後の神経学的予後を，より早期により高い精度で予測可能なバイオマーカーの発見と，心停止後の神経学的予後に大きく関与する全身の臓器の虚血/再灌流障害により引き起こされる心停止後症候群の病態解明に取り組んでいる．集中治療室へ入室した成人の心停止後患者の血漿中のタンパク質をSDS-PAGEにより分子量別に分離し，SDS-PAGE後のゲルはクーマシー染色で可視化し，そのバンドを40分割しtrypsinを用いてゲル内消化を行なった上で，質量分析装置を用いてタンパク質動態解析を行い，タンパク質の網羅的解析を行なった．その結果，神経学的予後不良群でのみ検出されたタンパク質を，ELISA法を用いて神経学的予後良好群と予後不良群間で比較検討し，神経学的予後不良群で有意に検出されるタンパク質を同定した．そのタンパク質を臨床検体でValidationを実施している.

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ禍の影響もあり, validationのための臨床検体が当初予定していたよりも集まっていない．それにより動物実験の開始が遅れている．コロナ禍における研究の体制も整いつつあり，5年度で予定している実験を確実に進めていけると考えている．

Strategy for Future Research Activity

令和5年度以降は, 心停止後神経学的予後不良群で有意に検出されるタンパク質の機能解析を行うための動物実験およびラットの心停止モデルを作成しその血液検体のプロテオミクス解析を行なっていく．動物実験を用いて発見したターゲットの遺伝子をknock down(抑制)，knock out(欠損)，over expression(過剰発現)し，心停止条件でのターゲット遺伝子の役割を明らかにする．
ラットの心室細動による心停止モデルを作成し，①健常ラット群（5検体），②心停止時間が5分間の心停止ラット群（5検体），③心停止蘇生時間が15分間の心停止ラット群（5検体）の3群にわけ，各々の群の血液検体をプロテオミクス解析する．なお，②5分間心停止ラット群はCPC（Cerebral Performance Categories）1，2を，③15分間心停止ラット群は，CPC3～5の患者群を想定し設定した．また各々の群の心停止から蘇生後7日間経過観察を行い，脳機能検査や行動実験および生存率を調査する．
さらには, 得られた結果を取りまとめ, 成果の発表を行う.

Causes of Carryover

本研究は，千葉大学分析センター質量分析室や，千葉大学医学附属病院マススペクトメトリー検査診断学寄付研究部門と連携しており，千葉大学医学研究院内の共有利用可能な研究設備・施設および千葉大学大学院医学研究院救急中治療医学講座でこれまで購入してきた研究設備を用いて行なっている．計画した研究を行うために必要な設備・装備の多くは整備されており，できる限り既存の設備を用いることで，新たな整備品導入のための費用は少なくしている．研究経費の多くは研究を行うために必要なタンパク質抽出用試薬，蛍光抗体実験試薬，SDS-PAGE試薬，電気泳動用各種試薬などの薬品・消耗品およびラットの購入のためにあてる予定である．