Development of minimally invasive therapy focusing on the molecular mechanism of hypoxia in human papilloma virus-related head and neck cancer

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16859
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 安慶名 信也 琉球大学, 病院, 講師 (30593496)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: HPV / HIF-1α / HPV陽性株 / HPV陰性株

Outline of Annual Research Achievements

頭頸部癌では低酸素状態に起因する低酸素誘導因子（HIF-1a）の発現と予後との関連性がみられている。HPV関連頭頸部癌において低酸素状態下の分子機構は報告が少ない。本研究では低酸素状態下のHPV関連癌の分子機構を解明し，それを応用した新規治療法の開発を最終目標としている。
2021年度は研究の第１段階として低酸素状態の頭頸部癌細胞株におけるHIF1-1α発現の解析、研究第２段階として凍結頭頸部癌組織を用いたHIF-1aと各因子の発現の解析を行っていく予定である。
現在研究第1に関して研究を進めている状況です。予備実験としてHPV陰性株、HPV陽性株を用いたHPV16の感染ウイルス数やE2（E6/E7発現を調整する遺伝子）についてはすでに基礎解析を終了し確認できているので、そのHPV陽性株とHPV陰性株を使用し1.5%濃度の低酸素環境をインキュベーターで作成し、HPV陽性細胞株（UMSCC、Caski）とHPV陰性細胞株（Scc4、SAS）の細胞培養を行うことで、どちらの細胞株でHIF‐1aの発現が亢進するか比較検討する実験を行っている。
予備実験で低酸素の条件を決めるためにReal-time PCRにおけるHIF-1aの遺伝子発現を確認し条件検討を行った。そのうえで再度細胞培養しHIF-1aの発現をWestern blotで確認した。現時点で低酸素条件においてどちらの細胞においてもHIF-1aの発現を認めている。
科研費申請書研究1に記した低酸素状態の頭頸部癌細胞株におけるHIF-1α発現解析における検討項目1）の低酸素状態での各細胞株のHIF-αの発現に関してはクリアできている。しかし、HPV陽性細胞株、HPV陰性細胞株それぞれでHIF‐1aの安定性（分解される時間）が変わっている可能性もあるので、次の実験でHIF‐1aの安定性を検証することで、細胞株毎にHIF-1aの発現に有意差がでるのか検討予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞株を使用した実験は初めてで不安であったが、インキュベーターにて低酸素状態の細胞実験をメインで行っている方の指導の下、現在のところ順調に進行できている。

Strategy for Future Research Activity

発現したHIF-1αの安定性の検証が必要である。いわゆるHIF-1aどれくらいの時間で分解されるのか（細胞内に維持される時間）を検討する。
cycloheximide（タンパク合成阻害剤）処理を行うことで，HIF-1αの合成をストップさせる。ウエスタンブロッティングにより処理時間を設定し、時間差によるHIF-1α発現と細胞株による差を計測する。
細胞株の実験にて検討した低酸素化の最適条件においてHIF‐1aの発現をHPV陽性株とHPV陰性株それぞれで一度上昇させたのちに、タンパク質合成阻害剤を入れて、HIF-1aの合成をストップさせる。そののちに時間を区切って培養してみる。
文献では2時間程度なのでそれぞれ1時間、2時間、4時間、6時間で細胞培養する。それぞれの時間ごとの細胞株より、タンパク質を抽出して、Western blotにてHIF-1aの発現を確認する。

Causes of Carryover

本年度に関しては細胞株など既存のものを使用できたことで予定した助成金を執行しなかったため、次年度には新たにPCRや免疫染色などのキットや抗体の購入や、研究成果の国内や国際学会での発表も予定しているので助成金をその分使用する予定である。