2021 Fiscal Year Research-status Report

CCN2-oriented anti-cancer drug screening

Research Project

Project/Area Number	21K17104
Research Institution	Health Sciences University of Hokkaido
Principal Investigator	堀江尚弘北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30802318)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	CCN2 / ゲノム編集 / 口腔扁平上皮癌 / iPS細胞
Outline of Annual Research Achievements	口腔がんに対して現在使用されている抗がん剤には，副作用，予後不良といった問題点があるため，分子標的治療薬としての新たな抗がん剤の開発が求められている。本研究では，標的因子として口腔扁平上皮癌の”悪性度”，”予後”を評価するマーカーとして有用な因子とされる結合組織増殖因子（CCN2）に着目し，新規抗がん剤の探索を試みる。令和3年度において，まずは研究の遂行に必要な実験器具・消耗品一式の購入，実験室を整備し，細胞培養・遺伝子解析等の分子生物学的研究をおこなう基盤を整えた。次に，研究で使用する3種類の口腔扁平上皮癌細胞および，対照群となるヒト歯肉線維芽細胞を培養・増殖させた。新規抗がん剤候補化合物の探索に用いる，CCN2遺伝子発現の変化を光学的に検知可能な”CCN2レポーター細胞”については，clustered regularly interspaced palindromic repeat（CRISPR）/Cas9 システムを用いたゲノム編集によって樹立予定であり，現在ガイドRNAの設計等の準備を進めている。更に，同化合物の骨への影響を推定するため，破骨細胞を用いたin-vitroの検討もおこなう予定とし，マウスから破骨細胞を採取する研究計画も立てている。 CCN2は，口腔以外の臓器のがんにおいても，腫瘍組織の増大に影響することから，本研究が完成し，新たな抗がん剤を発見できた暁には，歯科領域に限らず，全身のがん治療に貢献できる可能性を秘めており，本研究は大きな意義があると言える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 令和3年度は，研究の遂行に必要なマイクロピペット，電動ピペッターはじめ実験器具・消耗品一式を購入，実験室を整備し，細胞培養・遺伝子解析等の分子生物学的研究をおこなう基盤を整えた。次に，研究で使用する3種類の口腔扁平上皮癌細胞（HSC-2，HSC-3，SAS）および，対照群となるヒト歯肉線維芽細胞（hGF）を培養・増殖させた。細胞はどれも株化細胞であり，それぞれ指定のプロトコルもしくは、論文の手法を参考にして培養し，約10万細胞/バイアルのスケールでストックしている。加えて，新規抗がん剤候補化合物の探索に用いる，CCN2遺伝子発現の変化を光学的に検知可能な“CCN2レポーター細胞”の樹立に向け，CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を計画しており，現在ガイドRNAの設計等の準備を進めている。更に，薬剤候補化合物の口腔扁平上皮癌の骨転移に対する作用の評価を目標とし，同化合物の破骨細胞への影響を推定するため，まずはマウス由来の破骨細胞を採取する計画を立てている。方法としては近交系マウス（C3H/HeNSlcマウス）の大腿骨骨髄からMACSを用いてCD11b陽性細胞をソーティングし，M-CSFとRANKLで活性化させることで、破骨細胞の単離・培養を図る。以上が本研究の現在までの進捗状況であり，研究室の環境整備から開始したため，計画よりやや遅れているのが実情だが，研究基盤は整いつつある。
Strategy for Future Research Activity	今後はHSC-2，HSC-3，SASにCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を施し“CCN2レポーター細胞”の樹立をおこなう予定である。ゲノム編集に用いる各種コンストラクトを入手次第，研究を進める。CRISPR/Cas9システムでのゲノム編集が困難であった場合，まずはガイドRNAの配列の変更を試み，それでも細胞の樹立が難しければZFN，TALENといった別のゲノム編集技術の採用を検討する。また，並行してマウスから破骨細胞を採取する手技を確立し，同細胞を用いた評価系の構築を試みる。
Causes of Carryover	令和3年度はゲノム編集を実施できず，同用途の器材の一部を購入したため，次年度使用額が生じた。また，こうした計画の変更から細胞培養の規模が小さくなり，培地・器具・試薬等の購入量も減少したが，令和4年度は前年度に実施できなかった分の研究をおこなうため，当該助成金を翌年度分として請求した。