2021 Fiscal Year Research-status Report
3D analysis of chromatin structure in cell nucleus with electron microscopy and mathematical modeling
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21K18234
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
楯 真一 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 教授 (20216998)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟津 暁紀 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00448234)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | 核内クロマチン構造 / 電子顕微鏡 / 数理モデル / 分裂酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，分裂酵母を対象として共焦点顕微鏡による蛍光標識遺伝子座の核内動態をもとにクロマチン構造動態モデルを構築し，さらにこのクロマチン構造動態モデルをもとにFIB-SEMで観測する分裂酵母核内の3Ｄ構造データを再現する構造アンサンブルを構築する事により，核内クロマチン立体構造動態を明らかにする．
研究初年度の今年は，1）クロマチン構造動態モデル精密化のための核内遺伝子座の動態データのさらなる集積を進めた．特に，核内の2つの遺伝子座の距離の時間変化を新たに集積した．今期終了時点で，同じクロマチン内にある2つの遺伝子座の距離の時間変化については，8つのペアについてデータを集積した．また，核内構造モデル構築ではより重要となる異なるクロマチン間にある遺伝子座の距離の時間変化については12のペアについてデータを集積した．興味深いことに，観測された遺伝座間の距離の時間変動について隠れマルコフモデルによる状態数解析を行うと，いずれの場合も3つの状態間を遷移するという特異な動態が観測された．2）FIB-SEMにより，高精度の核内クロマチンの3Ｄ電子顕微鏡像を観測するための導電染色法の最適化とCLEM法適用するための試料調製法の最適化を進めた．標準的な試料調製法に加え，CryoChem法，CryoAPEX法を検討した．その結果，最も構造歪みの少ない調製法を確立できた．3）遺伝子座の動態データをもとにしたクロマチン構造動態モデルの最適化を進めた．共焦点顕微鏡で観測されたデータにおける，観測される蛍光色による色収差による距離評価の誤差を補正した構造動態モデルの構築を進め，これまでの構造モデルに修正を加えた精度を向上させた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子座間の動態データの集積が順調に進み，クロマチン構造動態モデル構築を進めるに十分なデータの集積を終えた．構造動態モデル精度を上げる上で必要であった観測データに含まれる誤差を回避する方法については解決できたために，より高精度の構造動態モデルが構築できた．電子顕微鏡試料調製については最適化が完了したが，当初予定していたアメリカNIHでの電子顕微鏡観測実験がコロナウイルス・パンデミックの影響で延期となったため，データ集積については次年度に持ち越しとなった．
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| Strategy for Future Research Activity |
すでにセントロメアと133箇所の遺伝子座の距離の時間変動データに加え，2つの遺伝子座間の距離の変動データを集積を終えたため，クロマチン構造動態モデルの構築へ集中する．今期中に距離評価に伴う誤差の問題を解決できたため，新たな計算法による構造動態モデルを構築する．
NIHの電子顕微鏡施設で，FIB-SEMによる核内クロマチンの3Ｄ電子顕微鏡像を計測する．今期に徹底的に導電染色法を最適化し，その方法により調整した資料をすでに調整済みであるために，早期にNIHでのデータ習得を進める．
FIB-SEMのデータを集積後は，3次元電子顕微鏡像を構築し，クロマチン構造動態モデルによる電子顕微鏡像の再現によるクロマチン構造動態を反映したアンサンブル構造を構築する．
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| Causes of Carryover |
コロナ感染拡大防止のために海外渡航ができなかったため，NIHでの電子顕微鏡実験が2021年度（令和3年度）では実施できなかったため，渡航費および試料調製用の準備経費の執行が持ち越しになったため．海外渡航の制約が軽減されつつあるために，速やかにNIHでの電子顕微鏡実験を進める．
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