2022 Fiscal Year Research-status Report
膜タンパク質超集積化のための無細胞固相合成システムの開発
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21K18324
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
佐々木 善浩 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90314541)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2026-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / 無細胞蛋白質合成 / 固相合成法 / 人工細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全タンパク質の半数以上を占める膜タンパク質の人工合成法の開発は、基礎生物学、医学、薬学において極めて重要であるが、膜タンパク質の簡便な合成は未だ 不可能である。本研究では、この膜タンパク質を固相システムにより大量合成する未踏科学技術に挑戦する。従来、膜タンパク質は、大腸菌などで過剰発現さ せ、界面活性剤により可溶化したのち、膜に再構成して得られる。この手法は、活性保持が困難、時間・コスト等が非効率、バイオハザードの危険、など多くの問題が残されている。この問題の解決に向け、本研究では、微粒子表面に担持した脂質膜（脂質膜コート微粒子）に対し、無細胞合成法により発現した膜タンパク質の直接組み込みを行うことを目的に研究を行った。研究遂行にあたり、以下の3点に焦点をあてて研究を遂行する。 1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用。研究の2年目にあたる2022年度は当初の計画に従い、ひきつづき上記の項目1)および2）について重点的に研究を行った。前年度までに、コロイド安定性の低い小さいリポソームとシリカ微粒子を混合し、膜融合を誘起することで、微粒子表面への脂質二分子膜を効率的に担持できることを明らかにしてきたが、このような微粒子を効率的に作成する手法を見出した。具体的には、新たに開発した脂質膜透過法を用い、脂質膜を効率的にコア微粒子に被覆する手法を見出した。また、磁性ナノ粒子を脂質膜と複合化する手法も開発した。さらに、複数の膜タンパク質を単一の微粒子に搭載するための手法の開発を目的として、固相合成法により脂質膜被覆微粒子に対して複数の膜タンパク質を簡便に搭載することが可能であることを予備的に明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2022年度においては、おもに1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、および、2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、について重点的に研究をおこなった。以下におのおのの研究項目における進捗状況をまとめた。
1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価: 通常、膜タンパク質を保持するために用いられるリポソーム（中空球状の脂質膜）は、比較的不安定かつハンドリングも困難である。この点を解決するため、コ ロイド安定性の低い小さいリポソームとシリカ微粒子を混合し、膜融合を誘起することで、微粒子表面への脂質二分子膜の担持を行った。この手法のさらなる効率化を狙い、本年度は脂質膜透過法によるシリカ微粒子の被覆を行なった。このようにして被覆した脂質膜は、通常のリポソームと同様の流動性、相挙動を有していることが、示差走査型熱量計による相状態評価などにより示された。また磁性ナノ粒子をこのような脂質膜に複合化する手法も明らかにした。
2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み：脂質膜コート微粒子存在下、再構築型の試験管内タンパク質合成系であるPURE systemを用いて目的とする膜タンパク質を発現させる。本年度は、この手法を用いて、複数の膜タンパク質を単一の微粒子に構築できることを明らかにした。具体的には、モデル膜タンパク質として、その取り扱いが比較的容易な、チャネルタンパク質Connexin-43とコロナウィルスのスパイクタンパク質を用い、連続的に固相合成を行うことで、それぞれの膜タンパク質が確かに発現していることを、ウェスタンブロッティング、蛍光抗体標識などにより、予備的に明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、および、2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、について重点的に研究をおこなう。まず、1) については、用いる微粒子を工夫することでその性質を最大限利用する方法を検討する。脂質膜コート微粒子としてナノサイズの空孔を有する多孔質シリカ微粒子や、pHや圧力に応答して溶解させることが可能な炭酸カルシウムなの微粒子を用いた系について検討を行う。さらに磁性ゲル微粒子を脂質膜と複合できることを明らかにしたので、核酸精製などで用いられる磁気による微粒子分離システムへの展開についての検討を行う。2)については、チャネルタンパク質、スパイクタンパク質にとどまらず、膜受容体、ヘマグルチニン、細胞接着に関わる膜タンパク質など多種のタンパク質を用いて本手法の一般性について検討を行う。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の自粛の流れにより、学生と共同で行う研究においても対面での実施が困難であったため、研究計画を若干縮小して研究を推進した。そのため、当該助成金が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画については、当初の計画に加えて、前年度遅延している計画について推進する予定である。具体的には、1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、および、2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、についての研究の拡充を目指す。具体的には、本年度、脂質膜コート微粒子の新規作製手法を開発したので、この系をさらに拡充、展開し、人工脂質のみならず天然の細胞膜を被覆できる系へと展開する。さらに、固相合成の自動化を見据え、市販のペプチド合成システムをプロトタイプとして用い、自動合成が可能であるかどうかについて検討を積極的に推し進める予定である。
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