2022 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集ヤギを活用したコンディショナルノックアウトによる排卵制御中枢の解明
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21K19187
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松山 秀一 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50455317)
森田 康広 帯広畜産大学, 畜産学部, 准教授 (90818262)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / キスペプチン / エレクトロポレーション / 受精卵 / GnRH / 排卵 / ヤギ / 卵胞嚢腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヤギ受精卵におけるゲノム編集により作出したゲノム編集ヤギを用いてキスペプチン遺伝子を視床下部内局所でノックアウト（KO）し、卵胞嚢腫病態モデルの作出に挑戦する。ウシの受胎率低下要因のひとつである卵胞嚢腫は、排卵を調節する視床下部神経機構の機能不全が原因と想定される。本研究では、ヤギをウシのモデル動物として用い、ゲノム編集により作出した卵胞嚢腫病態モデルにより、家畜の排卵制御中枢のメカニズムを解明することを目的とする。
本年度は、昨年度に引き続きヤギ受精卵におけるゲノム編集（受精卵エレクトロポレーション（EP））により、ゲノム編集ヤギの作出技術の確立を行った。キスペプチン遺伝子座への外来遺伝子ノックインは成功率が低いことが予想されたため、まず、キスペプチン遺伝子の全身性KOを試みた。ヤギキスペプチン遺伝子のエクソン2領域にガイドRNA（gRNA）を複数設計し、EGxxFPアッセイにより各gRNAの標的配列切断活性を評価して高効率な切断活性を示すgRNAを選定した。選定したgRNAにより、過剰排卵誘起処置を施したヤギから採取した1細胞期胚を用いてゲノム編集を行い、ゲノム編集胚の胚発生率およびゲノム編集胚のジェノタイピングによるゲノム編集率を指標として、最適なEP条件を決定した。最適化したEP条件により1細胞期胚のゲノム編集を行い、得られたゲノム編集胚を発生培養した後に受胚ヤギに移植後、産子（雄1頭）を得た。産子のジェノタイピングにより、片アレルにおいてキスペプチン遺伝子座に5塩基の欠損があるフレームシフト変異が生じていることが明らかとなった（Kiss1ヘテロ変異体）。今後、Kiss1ヘテロ変異体の経時的な体重測定による成長特性評価と、黄体形成ホルモン分泌動態の解析による繁殖機能評価を実施するとともに、交配によりKiss1ホモ変異体（KO個体）を作出する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画では、1細胞期受精卵におけるゲノム編集技術（受精卵エレクトロポレーション法：GEEP法）により、キスペプチン遺伝子座にloxP配列を配置した外来遺伝子をヤギ受精卵に導入し、遺伝子ノックイン胚を発生培養した後に受胚ヤギに移植することを予定していた。しかし、キスペプチン遺伝子座への外来遺伝子ノックインは成功率が低いことが予想されたこと、また、ゲノム編集ヤギの作出はこれまで報告例がないことから、より平易な手法であるキスペプチン遺伝子の全身性ノックアウトによりゲノム編集ヤギを作出する技術の確立を主眼とした研究を実施した。エレクトロポレーション条件の検討およびその最適化により、高いゲノム編集率を得る手法を確立できた。また、1細胞期胚におけるエレクトロポレーションによるゲノム編集により得られたゲノム編集胚を移植した受胚ヤギから、片アレルにおいてキスペプチン遺伝子座に5塩基の欠損があるフレームシフト変異を持つKiss1ヘテロ変異体を得ることができた。今後は、Kiss1ヘテロ変異体の成長特性、繁殖機能評価などを実施するとともに、交配によりKiss1ホモ変異体（KO個体）の作出をめざす。以上より、ヤギにおけるゲノム編集技術の確立についてはおおむね順調に推移したと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、1細胞期受精卵におけるゲノム編集技術による相同組み換えを利用してキスペプチン遺伝子に外来遺伝子を導入し、遺伝子ノックイン胚を受胚雌ヤギに移植してゲノム編集ヤギを作出することをめざしている。これまでの本研究で、GEEP法によるゲノム編集技術が確立できたことから、今後は、キスペプチン遺伝子座にloxP配列を配置した外来遺伝子を導入したゲノム編集ヤギ（Kiss1-floxedヤギ）よりも汎用性の高いゲノム編集動物である、キスペプチンニューロンにCreリコンビナーゼ遺伝子を導入してキスペプチンニューロン特異的にCreリコンビナーゼを発現するゲノム編集ヤギ（Kiss1-Creヤギ）の作出に取り組む。
全身性キスペプチン遺伝子ノックアウトヤギについては、今年度得られたKiss1ヘテロ変異体の成長特性、繁殖機能評価などを野生型個体と比較する実験が進行中であり、次年度も継続して実施する。
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