2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K19203
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
大学 保一 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (80619875)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 複製開始点 / DNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究開始以前まではPu-seq実験の対象をPolεのみとしていたが，2021年前半までに，まず，Polαを対象とするPu-seq実験方法を確立した．その後，その方法を発展させ，現在までにPOLE1，POLA1変異体を使用して，Polε・Polαによって取り込まれるrNMPのゲノム上の分布を解析し，それらのポリメラーゼによるリーディング鎖，ラギング鎖の合成領域をDNA鎖（Watson鎖，Crick鎖）に分けて明らかにした．結果として，PolεとPolαの取り込みが高い領域がゲノムDNAの両鎖で交互に存在することが示された．これは，Polεによるリーディング鎖合成は複製開始領域より3’側に分布し，Polαその逆側に分布することを意味する．よって，それぞれのポリメラーゼの合成プロファイルの微分量から，複製開始反応を置きやすさを示すinitiation indexを算出した．その結果，Initiation indexがピークを成す領域をゲノム上に8000か所ほど同定することができ，それらは複製開始を活発に行う領域であり，この方法により世界でも類を見ないほど，高精度に複製開始点を同定することが可能となった．また，複製フォークの方向性などに関しても，PolεとPolα両方の合成プロファイルを使用して解析することにより，高精度かつ定量的に示すことができるはずである．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験開始当初予定していた通り，Polε・Polα両方を対象としたPu-seq実験を確立することにより，リーディング鎖・ラギング鎖の両方のプロファイルから，複製フォークの動態を非常に高精度に解析することが可能となり，今後，そのデータを指標に転写の様々なプロセスのDNA複製への影響を解析することが可能となった．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，予定していた通り転写による複製フォーク動態をの影響を検証するステージに進む．まずは，Pu-seq実験のデータを利用し転写がDNA複製の開始反応や複製フォークの進行に影響を及ぼすかを検証する．その後，転写の各過程で機能する因子の阻害剤の添加，該当遺伝子の不活性化した細胞を回収し，Pu-seq実験を同時に行い，RNAポリメラーゼとDNA複製機構の関係性を明らかにする．
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| Causes of Carryover |
2021年度は予定していたよりもDNA配列解析の回数が少なかったため，2022年はその分，多くのDNA配列解析を行う予定である．
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