2021 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリアを欠失させた真核細胞の構築とその分子細胞生物学的解析
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21K19204
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 由実 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (80268193)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 鉄硫黄クラスター / 出芽酵母 / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母のミトコンドリアにおける唯一の必須機能はISCマシナリーによる鉄硫黄（Fe-S）クラスターの生合成であり、それ以外のミトコンドリア機能（酸化的リン酸化など）は失っても富栄養培地であれば生育することができる。そこで本研究では、酵母のサイトゾルだけでFe-Sクラスターを生合成できるように改変を施すことで、ミトコンドリアISCマシナリーの機能をバイパスさせ、“ミトコンドリアを持たない真核細胞”をはじめて実験的に創り出すことを最終的な目標としている。R3年度は、バクテリアのFe-Sクラスター生合成系であるNIFマシナリーを酵母のサイトゾルで発現させ、ミトコンドリアのISCマシナリーをバイパスさせることを目指して、以下の研究を進めた。
ピロリ菌由来のNIFマシナリーの２成分（NifSとNifU）は、大腸菌などのISCマシナリーの機能をバイパスさせることができる。そこで、これらを構成的なプロモーターの下流にクローニングし、酵母サイトゾルで発現させた。嫌気条件下でスクリーニングを行ったところ、酵母ISCマシナリーの必須成分であるJAC1遺伝子の破壊株を初めて得ることができた。また、破壊株の表現型からミトコンドリア内のFe-Sタンパク質群（TCA回路や電子伝達系）は機能していないが、サイトゾルや核のFe-Sタンパク質群は正常と推定された。ただし、別の必須遺伝子であるNFS1の破壊株は得られなかった。Nfs1はシステイン脱硫黄酵素として、ミトコンドリアでFe-Sクラスター生合成系に硫黄を供給するだけでなく、核内におけるtRNAの硫黄修飾系にも硫黄を供給することが知られている。そこで、培地に高濃度の硫黄を添加するといった種々の条件を試しているが、これまでNFS1破壊株の構築には成功していない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NIFマシナリーを発現させた酵母で、JAC1遺伝子は破壊できたものの、NFS1の破壊の破壊株は得られていないため、種々の条件を検討する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
JAC1遺伝子は破壊できたがNFS1遺伝子は破壊できなかった理由として、Nfs1の多機能性が考えられる。このNfs1はシステイン脱硫黄酵素として、ミトコンドリアでFe-Sクラスターの生合成系に硫黄を供給するだけでなく、核にも微量存在して、tRNAの硫黄修飾系に硫黄を供給することが知られている。そこで、ミトコンドリア移行配列を除去したNFS1のコピーをNIFマシナリーと共に酵母のサイトゾルで発現させることで、ミトコンドリアにおけるNfs1の機能のみをバイパスさせるという方向で実験を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
ミトコンドリアISCマシナリーの必須成分をコードする遺伝子のうち、JAC1は破壊できたがNFS1は破壊できないという想定外の現象に遭遇し、予定を延長して慎重に検討を行ったため残金が発生した。R4年度に、破壊株の構築に必要な合成オリゴDNAやクローニングに必要なキット・試薬の購入、また種々の培養条件を検討するための費用にあてる計画である。
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