Development of gene-based therapeutic approach for Down syndrome using novel genome editing technology

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19448
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80506494)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ダウン症候群 / ゲノム編集 / アストロサイト

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群では、21番染色体トリソミーにより重篤な知的障害と認知障害が起こる。我々はダウン症候群のアストロサイトではNLRP3インフラマソームの活性が亢進し、神経細胞に強い変性細胞死をもたらし、かつその原因遺伝子がDYRK1Aであることを明らかにした。本研究ではそのコピー数を正確に修正するために、新規のゲノム編集技術CRISPR-Cas3に注目し、アレル特異的SNPを用いてDYRK1Aのアレル選択的コピー数修正を行うことを目指している。
本年度はまず神経細胞・アストロサイト共培養系をもちいて、DYRK1Aの選択的コピー数補正法の確立を目指した。あるダウン症児の臍帯血に由来するiPS細胞のゲノム配列を精査し、DYRK1Aの3つのアレルのうち1つだけに存在するSNPを探した。DYRK1Aはexon4-9にかけてcatalytic domainが存在するため、exon4-6の近傍で1アレル特異的なSNPを探したところ、4つのSNPが見つかった。一方、CRISPR-Cas3のガイドRNAをデザインする場合、PAM配列であるAAG配列、それに引き続くSeed領域と呼ばれる8塩基が重要であり、1塩基変化を認識するにはこの11塩基の中にSNPが含まれる必要性がある。この条件に合うSNPが1つだけ存在し（dbSNPに登録されているrs11701810）、GEM-J WGAでは日本人の頻度は0.36であった（おそらく約2－3割のダウン症患者がこのSNPをもつと考えられる）。このSNPがCas3のseed配列に含まれるようにguide RNAをデザインした。
今後このguide RNAをもちいてCRISPR-Cas3を作用させ、DYRK1A発現量が適切に低下することを確認する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

iPS細胞においてSNPとCRISPR-Cas3をもちいた選択的コピー数修正がうまく作用していることを確認することができ、おおむね順調な伸展と思われる。

Strategy for Future Research Activity

今回作成したguide RNAとCRISPR-Cas3をもちいてiPS細胞に作用させ、DYRK1Aのexon3,4 のゲノム量を確認するとともに、DYRK1A発現量（RNA量）が減少することを確認する。
続いてこのCRISPR-Cas3を作用させたiPS細胞をアストロサイトへ分化誘導し、DYRK1A発現量が低下し、かつNLRP3インフラマソームが減少すること、さらにこのアストロサイトとニューロンを共培養することでニューロンのアポトーシスが抑制されることを確認したい。また神経細胞への作用の有無やオフターゲット効果の有無についての確認を行う。

Causes of Carryover

動物実験施設の改修工事により動物の搬入ができなかったため、in vivoでの解析を次年度に行うこととなった。