Establishment of new fluorescent cytology targeting cancer cell-specific porphyrin metabolism abnormalities

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19617
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 里村 一人 鶴見大学, 歯学部, 教授 (80243715)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 徳山 麗子 鶴見大学, 歯学部, 学内講師 (20380090) ; 井出 信次 鶴見大学, 歯学部, 助教 (00611998) ; 寺田 知加 鶴見大学, 歯学部, 助教 (40460216) ; 竹部 祐生亮 鶴見大学, 歯学部, 助教 (50807097) ; 伊藤 由美 鶴見大学, 歯学部, 講師 (00176372)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 蛍光細胞診断 / 5-ALA / 口腔癌

Outline of Annual Research Achievements

癌の早期発見を可能とする安全、簡便、経済的かつ高感度な診断法・検出法の開発が望まれている。現在、癌の診断に用いられている細胞診断は患者の身体的負担が少なく、手技も比較的簡便であること、さらに最近細胞診断用の各種キットが開発され診断プロセスの定型化が進んだことから、現在大きく普及しつつある。しかしいずれも細胞の形態的特徴と染色態度を基準として診断する方法であり、異常細胞における細胞内代謝変化などの機能面の評価を診断のために利用しようとする試みは未だなされていない。これまでにわれわれは、細胞の機能異常を早期に捉えることを目的に、口腔癌に対する5-ALAを用いた光線力学的診断（ALA-PDD）の可能性につき検討を行ってきた。その結果、上皮内癌（carcinoma in situ）に対しては感度91.2％、特異度91.3％、高度上皮性異形成（WHO2017）に対しては感度85.2％、特異度91.3％での検出に成功した。このことから、本法は簡便かつ安全で、患者負担の少ない新たな口腔癌診断法になり得るという確信を得、学会等で広く報告してきている。そこで本研究では、このALA-PDDの原理を細胞診にも応用できる点に着目し、5-ALAを用いた新たな細胞診（ALA-Cytology）を確立できる可能性について検証することを目的とした。
本年は、in vitroにおける口腔癌細胞およびその他の癌細胞に対する5-ALAの効果について検討した。口腔癌細胞およびその他の各種癌細胞、さらにそれぞれの発生組織に由来する正常細胞を各種濃度の5-ALAで処理し、一定時間後に蛍光顕微鏡（405nm励起）を用いて細胞の赤色蛍光を観察し、腫瘍細胞と正常細胞間での蛍光強度差、また癌細胞の種類や細胞生物学的特徴（悪性度や分化度）による蛍光強度差について検討し、最も蛍光強度差の得られる処理条件の特定進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通りに進行しており、今後はさらに条件の検討を追加するとともに、各種の全身における腫瘍細胞を対象とした検討の準備、さらには組織診断との比較検討の準備が進んでいるため。

Strategy for Future Research Activity

口腔癌細胞およびその他の各種癌細胞、さらにそれぞれの発生組織に由来する正常細胞を用いて細胞の赤色蛍光を観察し、腫瘍細胞と正常細胞間での蛍光強度差、また癌細胞の種類や細胞生物学的特徴（悪性度や分化度）による蛍光強度差について検討し、最も蛍光強度差の得られる処理条件の特定を各細胞毎に行う。さらに細胞毎に決定された条件で処理した癌細胞を、従来の細胞診で行われている工程で処理した後、Papanicolaou染色、Giemsa染色、PAS染色、Alcian blue染色などを行い、5-ALA処理が各癌細胞の染色態度に及ぼす影響につき検討し、5-ALA処理が従来の細胞診判定や診断精度に与える影響について明らかにする。対象とする癌細胞として、口腔癌細胞株では口腔底扁平上皮癌由来HO-1-u-1細胞株、歯肉扁平上皮癌由来Ca9-22細胞株、舌扁平上皮癌由来のHSC-4細胞株、HSC-3細胞株およびSAS細胞株の5細胞株を予定し、必要に応じて口腔癌から新たに分離した癌細胞を併せて利用する。また他の臓器・組織に由来する癌細胞として、子宮頸癌由来HeLa細胞株およびOMC-1細胞、肺癌由来HLC-1細胞株、A549細胞株およびRERF-LC-A1細胞株、乳癌由来OCUB-1細胞株およびMDA-MB-453細胞株、膀胱癌由来T24細胞株およびMBT-2細胞株、甲状腺癌由来HTC/C3細胞株およびT3M-5細胞株を予定している。
さらに、口腔癌（あるいは上皮性異形成）を疑う口腔粘膜病変を有する患者を対象として、ALA-PDDを施行し、赤色蛍光が認められた部位に対して細胞診を実施し、通法により塗抹標本を作成する。赤色蛍光が認められた同一部位から生検により組織を採取し、通法により病理組織学的診断を行うことで、本診断法の有効性についても検証する予定である。

Causes of Carryover

本年度施行予定であった各種細胞を対象とした検討において、現在、予定通り進んでいるが、口腔癌細胞での検討結果が想定よりも進んだため、口腔癌細胞を先行して進めている。このため、他の癌細胞および正常細胞での検討が完了しておらず、これを次年度繰り越しとした。また、患者を対象とした組織診断等との比較検討についても口腔癌での結果を待って実施を予定しているため、これらも次年度繰り越しとしている。次年度はこれらの検討を行い、さらなる診断法開発のための研究を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Surface Functionalization of Non-Woven Fabrics Using a Novel Silica-Resin Coating Technology: Antiviral Treatment of Non-Woven Fabric Filters in Surgical Masks (2022)
  • Author(s): Tsutsumi-Arai C, Iwamiya Y, Hoshino R, Terada-Ito C, Sejima S, Akutsu-Suyama K, Shibayama M, Hiroi Z, Tokuyama-Toda R, Iwamiya R, Ijichi K, Chiba T, Satomura K
  • Journal Title: Int J Environ Res Public Health Volume: 19(6) Pages: 3639
  • DOI: 10.3390/ijerph19063639
  • Peer Reviewed / Open Access