ROCKシグナルを標的とした犬悪性黒色腫の新規治療法の探索

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K20614
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 高橋 洋介 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任研究員 (50912549)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2023-03-31
• Keywords: 犬 / 腫瘍 / 悪性黒色腫 / ポドプラニン / Rho kinase / 分子標的薬

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、申請者が同定した犬悪性黒色腫の新規治療標的である「PDPN-ROCKシグナル」の阻害による新たな全身療法の確立を目指した前臨床研究を行う。

本年度は、PDPNを高発現する犬悪性黒色腫細胞株2株を用いて、PDPNのノックアウト実験を行い、PDPN欠損株の機能変化およびシグナル変化、網羅的遺伝子発現変化の検証を行ってきた。その結果、PDPN欠損株のトランスウェルアッセイ、マトリゲルアッセイ、WST1増殖アッセイ、AnnexinV FACS染色法を用いた解析により、移動能、浸潤能、増殖能が有意に低下し、アポトーシス細胞率が有意に上昇していることを明らかにした。さらに、PDPN欠損株を免疫不全マウス(BALB/c nu/nu)に移植したところ、腫瘍の成長が有意に抑制された。ウェスタンブロットを用いたPDPN欠損株のシグナル解析では、ROCKシグナル(p-MYPT1, p-MLC2)およびERK, p38, JNKなどのMAPK(mitogen-activated protein kinase)経路分子の活性化の低下が認められた。網羅的遺伝子発現変化については、現在、RNAシークエンス解析が完了し、得られたデータの解析を行なっている。

上記実験結果より、犬悪性黒色腫において、PDPNおよびROCKシグナルを介した移動能、浸潤能、増殖能の獲得が示唆されたことから、犬悪性黒色腫細胞株にROCK阻害剤3剤(Fasudil, Y-27632, GSK269962A)の添加を行ったところ、PDPN欠損株と同様に移動能、浸潤能、増殖能の低下およびアポトーシスの誘導が認められた。現在、ROCK阻害剤添加時のシグナル変化の解析やin vivo実験の準備を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度、in vitro実験を主に進め、PDPNシグナルの下流にROCKが存在し、犬悪性黒色腫細胞株の移動能、浸潤能、増殖能を担っていること、また、ROCK阻害剤によりそれらを阻害できることを明らかにできたため。

Strategy for Future Research Activity

PDPN欠損株のRNAシークエンスデータの解析を進めるとともに、ROCK阻害剤を添加した際のin vitroでの機能やシグナル変化の詳細解析およびin vivo抗腫瘍効果の検証を進める。

Research Products

• [Journal Article] Expression of podoplanin in various types of feline tumor tissues (2021)
  • Author(s): KAMOTO Satoshi、SHINADA Masahiro、KATO Daiki、TSUBOI Masaya、YOSHIMOTO Sho、YOSHITAKE Ryohei、ETO Shotaro、IKEDA Namiko、TAKAHASHI Yosuke、HASHIMOTO Yuko、CHAMBERS James、UCHIDA Kazuyuki、YAMADA Shinji、KANEKO Mika K.、NISHIMURA Ryohei、KATO Yukinari、NAKAGAWA Takayuki
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 83 Pages: 1795～1799
  • DOI: 10.1292/jvms.20-0608
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] イヌ悪性黒色腫のPDPN-ROCKシグナルを標的とした新たな分子標的治療の検証 (2022)
  • Author(s): 品田真央、加藤大貴、池田凡子、李捷生、小寺優佳、青木督、太田崚介、高橋洋介、橋本裕子、坪井誠也、チェンバーズジェームズ、内田和幸、加藤幸成、西村亮平、中川貴之.
  • Organizer: 第25回日本獣医がん学会学術集会
• [Presentation] 犬悪性黒色腫に対する抗ポドプラニン抗体を用いた分子標的治療の開発 (2022)
  • Author(s): 嘉本諭、加藤大貴、品田真央、坪井誠也、池田凡子、青木督、小寺優佳、李捷生、太田崚介、高橋洋介、橋本裕子、チェンバーズジェームズ、内田和幸、金子美華、西村亮平、加藤幸成、中川貴之
  • Organizer: 第25回日本獣医がん学会学術集会
• [Presentation] Podoplanin promotes the tumor growth of canine malignant melanoma via Rho-associated kinase signals (2021)
  • Author(s): Masahiro Shinada, Daiki Kato, Namiko Ikeda, Toshio Li, Yuka Kodera, Masaya Tsuboi, James Chambers, Kazuyuki Uchida, Yukinari Kato, Ryohei Nishimura, Takayuki Nakagawa.
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会