2021 Fiscal Year Research-status Report
Optimization of multiple method baced on neutron reflectometry for analysis of biogenesis of Gram-negative bacterial membrane.
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21KK0126
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
塩田 拓也 宮崎大学, キャリアマネジメント推進機構, 准教授 (20819304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田岡 東 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (20401888)
宮崎 亮次 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30827564)
竹田 弘法 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (80816588)
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| Project Period (FY) |
2021-10-07 – 2024-03-31
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| Keywords | 中性子反射率法 / BAM複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生体高分子の高い時空間分解能での解析を実現する手法として、中性子反射率法を中心に、in vivoでの架橋法、クライオ電子顕微鏡による構造解析、高速AFM、そして単離膜を用いたin vitro再構築実験の5つの多角的な手法を駆使し、これらを組み合わせた統合的な解析法の確立を目指している。そのモデルケースとして、大腸菌のBAM複合体を中心とした外膜タンパク質輸送複合体および、磁性細菌のマグネトソーム形成タンパク質を用いる。初年度は、国際共同研究先の渡航制限が解除されず、オンラインでの共同研究にとどまったが、BAM複合体の中性子反射率実験で得られたデータ解析を共同で実施し、基質が結合した状態のBAM複合体の分子形態を決定することができた。また、in vitro再構築実験系では、輸送されるタンパク質が持っている新規シグナルを決定し、過渡的な中間体を形成する新規条件を確立した。また、架橋実験では、多様な因子による補助を必要とするLptDのアセンブリーに着目し、それぞれの因子がどのように相互作用しているかを高い空間分解能で決定した。さらにクライオ電子顕微鏡による構造解析では、輸送装置の精製に成功し、現在再構築実験で見出された中間体の構造解析を実現すべく変異基質の精製を進めている。また、高速AFMでは、マグネトソームの形成再現に必要な因子を同定するとともに、マグネトソーム小胞の精製法を検討した。さらに、細菌表層の高速AFMによるイメージングのための固定化技術の確立および、動的な物性変化を捉えることに成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
海外共同研究先への渡航については、制限が解除されず一年先延ばしになったが、その期間に国内で可能な解析で着実に成果が出ている。具体的には、外膜タンパク質輸送に関わる、新規シグナルの同定や、過渡的複合体を形成する際の構成因子およびその相互作用部位の詳細な決定。さらには、高速AFMで細菌表層をモニターするための固定化技術の確率がある。これらが実現できたことにより、現在渡航制限が解除された豪州において中性子反射率法による解析を迅速に進めることができる。よって、研究計画は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
BAM複合体に基質が結合した輸送中間体の分子形態を、中性子反射率法により決定する。また、架橋法により同定された、関連因子を加えた新規中間体を中性子反射率法で測定する。これらの分子形態をクライオ電子顕微鏡による立体構造解析により詳細に理解することを目指す。さらに、マグネトソームの形成機構を中性子反射率法で解析するための再構築実験系の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
初年度は、共同研究先の渡航制限により出張が制限されたため、残額が生じた。初年度に渡航し研究の初期データを取得する予定であったが、各班が実データを的確に所得できたため、二年目に着実に国際共同研究を実施できる準備が整っている。
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