2012 Fiscal Year Annual Research Report
原発性免疫不全症における遺伝子変異の修復による自己細胞再生療法の開発
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22249043
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
原 寿郎 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40150445)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高田 英俊 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70294931)
井原 健二 九州大学, 大学病院, 准教授 (80294932)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 遺伝子治療 |
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| Research Abstract |
CD34陽性造血幹細胞よりIgM陽性未熟B細胞まで分化誘導するフィーダー細胞を用いない培養系に関し、より最適な培養条件を検討し、効率よくB細胞を誘導しうる培養系を確立した。本培養系を用い、BTK遺伝子へ相同組換えによりターゲティングされた造血幹細胞の、B細胞系への分化能を検討した。正常ヒト男性臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞を培養し、ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させ、ハイグロマイシンによる薬剤選択を行った。適切な薬剤選択条件を検討し、5週間の培養後、ハイグロマイシン耐性CD19陽性B細胞でBTK遺伝子へのターゲティングの成否を調べた。前年度は検体数がわずかであったため、今回複数の検体で検討し、BTK遺伝子へのターゲティングを証明した。これにより、相同組換えされたCD34陽性細胞が造血前駆細胞のみならず、B細胞系への分化能を持つことを証明し、本ベクターを用いた遺伝子修復により、B細胞系の分化停止を修復しうる可能性を示した。
また、相同組換え効率の改善を図るために、恒常的な発現制御が期待できるEF1プロモーターおよびピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを作製したが、更なる効率向上を目指し最適なプロモーター、薬剤選択遺伝子を検討している。
iPS細胞を用いた研究では、正常ヒトiPS細胞株を用いて、iPS細胞よりB細胞へ誘導する培養系の確立を目指し、iPS細胞よりCD34陽性細胞を誘導し、その後CD34陽性造血幹細胞よりB細胞へ分化誘導する系を応用して現在検討中である。
ヒト化XLAモデルマウスでは、BTK-cDNA搭載レンチウイルスベクターの改変を行い、遺伝子導入およびB細胞分化の検討を続けている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CD34陽性造血幹細胞でのターゲティングによる遺伝子修復能を証明し、その細胞がB細胞系へ分化しうることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
相同組換え効率の改善を図るために作製した、恒常的な発現制御が期待できるEF1プロモーターおよびピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを用い、相同組換え頻度の向上が見られるかを検討する。臍帯血由来CD34陽性細胞と同様に、In vitroでフィーダー細胞を用いずにCD34陽性造血幹細胞よりB細胞系へ分化誘導研究を行い、分化能を評価するための培養系を確立する。
また、更なる効率上昇を目指し、改良型ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを作成する。具体的には、相同組み換え修復後の遺伝子配列の検出を考慮し、ベクターに搭載する遺伝子領域および配列を再検討する。最適な薬剤耐性遺伝子を搭載しin vitroでの遺伝子治療モデルの確立を目指す。
iPS細胞から造血幹細胞をへて、B細胞へ分化誘導する培養系を確立する。確立後、XLA患者由来iPS細胞へターゲティングによる遺伝子修復を行い、B細胞分化能を検討する。
ヒト化XLAモデルマウスでは、レンチウイルスベクターを用いてBTK遺伝子導入を行い、in vivoでのB細胞分化、抗体産生能の検討を行う。
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Research Products
(4 results)
