次世代シークエンサーを用いた難聴遺伝子の網羅的解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22249057
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 宇佐美 真一 信州大学, 医学部, 教授 (10184996)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 工 穣 信州大学, 医学部, 准教授 (70312501) ; 東野 哲也 宮崎大学, 医学部, 教授 (80145424) ; 佐藤 宏昭 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40215827) ; 古屋 信彦 群馬大学, 医学部, 教授 (80107606) ; 熊川 孝三 財)沖中記念成人病研究所, 虎の門病院, 研究員 (40142252)
• Keywords: 内耳 / 遺伝子 / 感音難聴 / 細胞外マトリソクス

Research Abstract

難聴の原因遺伝子はおおよそ100種類ぐらい存在すると考えられているが、従来の直接シークエンス法ではスループットが低いため、数遺伝子を解析するのが限界であり、遺伝子変異を検出できない例が多く認められる状況であった。
本研究では、次世代シークエンサー(ゲノムシークエンサー)を用いることで、難聴の原因候補遺伝子の全塩基配列を決定し、網羅的に解析を行うことで、より診断率を向上させることを計画した。
平成22年度は、難聴患者約200名を対象に、コバリスを用いてDNAをおおよそ200塩基に断片化した後に、Agilent社のSureselectを用いた選別法により、候補遺伝子領域を含むDNA断片の濃縮を行う。濃縮後はシークエンス用のアダプターを付加した後に、ブリッジPCRを用いてDNAの増幅を行ない、次世代シークエンサーにより全塩基配列の決定を行なった。
Agilent社のSureselect等を用いた候補遺伝子領域の選択的濃縮に際しては、海外の文献や、Hereditary Hearing loss Homepageを参考に、既に報告されている難聴の原因遺伝子や、まだ遺伝子までは明らかになっていない原因座位に対するビオチン化オリゴをカスタム合成し、pull down法により選別した。
次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析の結果、複数の難聴の原因遺伝子変異を同定しており、現在サンガーシークエンスを用いた確認作業を進めている状況であり、十分な成果が得られており、次年度以降に向けて順調に解析を実施できた。