2012 Fiscal Year Annual Research Report
迅速な遺伝子破壊法を用いたマウス・ノンコーディングＲＮＡの機能解析
| Project/Area Number |
22310118
|
|---|
| Research Institution | Nara Medical University |
|---|
Principal Investigator |
堀江 恭二 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2014-03-31
|
| Keywords | ES細胞 / ゲノム / 遺伝子 / non-coding RNA / 変異体 |
|---|
| Research Abstract |
近年、哺乳動物細胞には、mRNA型のnon-coding RNAが大量に存在することが明らかになった。しかし、non-coding RNAを、機能面から網羅的に解析する手法は存在しない。我々は最近「マウスES細胞でホモ変異体を迅速に作製する方法」を独自に開発し、多数のホモ変異体ES細胞を樹立してきた。本研究では、これらのホモ変異体ES細胞株の中から、non-coding RNAが破壊されたホモ変異体ES細胞を同定し、表現型解析を行っている。
表現型解析法として、ES細胞の分化誘導前後でtotal RNAを精製し、qRT-PCRによる未分化マーカーや分化マーカーの定量を行った。変異細胞株の中には、ひとつの細胞株の中で個々の細胞ごとに表現型に多様性を示すものも散見されたので、未分化マーカーや分化マーカーを免疫染色することにより、表現型のばらつきについても評価を行った。我々は遺伝子破壊に遺伝子トラップベクターを用いており、そのベクターの両端にはFRT配列を配置している。そこで、Flpリコンビネースを発現させてベクターの大部分を除去し、表現型の消失を確認することで、ベクターの挿入部位の遺伝子が表現型の原因であることを確認した。
上述のように同一細胞株内でも個々の細胞ごとに表現型がばらつくことを観察したので、生細胞での時系列解析の必要性を感じた。そこで、蛍光蛋白を用いてES細胞の未分化性を評価するための実験系の構築を開始した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光蛋白を用いた生細胞観察は当初計画に無かった。この手法を取り入れることで、全体の研究計画自体は若干の遅れを生じたが、将来的にはより精密な情報収集に繋がり、研究の進展へ寄与すると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
蛍光蛋白を用いた時系列解析を導入することで、ES細胞ならではの動的な表現型解析を可能にし、独創的な研究へ繋げたい。
|
-
[Journal Article] An in vitro ES cell-based clock recapitulation assay model identifies CK2a as an endogenous clock regulator2013
Author(s)
Umemura Y, Yoshida J, Wada M, Tsuchiya Y, Minami Y, Watanabe H, Kondoh G, Takeda J, Inokawa H, Horie K, Yagita K.
-
Journal Title
PLoS One
Volume: 8
Pages: e67241
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
