2010 Fiscal Year Annual Research Report
プライマーRNA合成活性をもつプラスミド複製開始蛋白質の機能と構造
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22570003
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
伊藤 建夫 信州大学, 理学部, 特任教授 (40051817)
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| Keywords | 遺伝学 / 酵素 / 核酸 / 細菌 / プラスミド / DNA複製 / プーイマーRNA |
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| Research Abstract |
複製開始部位特異的結合という他の系のDNA複製開始蛋白質と共通の活性のほかに、「複製開始部位特異的プライマーRNA合成活性を合わせ持つ」という他の系にない特異な性質をもつColE2群プラスミドの複製開始蛋白質Repの機能と構造を遺伝学的、生化学的に明らかにするとともに構造生物学的解析へ結び付けることを目的として研究を行った。
1ColE2プラスミドのRepのプライマー合成活性中心を構成する可能性のある酸性アミノ酸残基の候補の絞り込みのため、酸性アミノ酸残基の一アミノ酸置換変異体について、活性の高温感受性の有無を調べた。その結果、高温感受性の傾向を示すものを見出したので、さらに詳細な解析を進めている。
2ColE2プラスミドの複製開始部位Oriの一塩基置換変異体の内、Repをトランスに供給したときに複製効率が低下ないし消失したものについて、複製効率を詳細に測定するため、Repがシスに供給される自立複製型構造(元々のプラスミドの構造)へ一塩基置換変異Oriを導入することを試みた。多数の変異体について効率的に、かつ確実に自立複製型構造を構築するために、クローニングベクター上でこの構造を構築した後、クローニングベクターから切り離す方法をとることとした。現在、そのようなクローニングベクターへ一塩基置換変異Oriの導入を行っている。
3高度好熱菌を宿主とするColE2群プラスミドpTT8のOri中のプライマーRNA合成位置とその配列を決定できた。なお、共同研究としてRepのX線結晶構造解析を試みている国立遺伝学研究所助教伊藤啓氏は、pTT8のRep蛋白質の部分ペプチドの内、水溶性の高いものについて微結晶の生成に成功した。現在、X線結晶構造解析に適する結晶の生成を試みている。
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