2012 Fiscal Year Annual Research Report
セルロース系バイオマスの完全酵素糖化を目指したセルラーゼの高機能化
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22580090
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
川口 剛司 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (70195056)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
炭谷 順一 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (10264813)
谷 修治 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (80405357)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | セルラーゼ / β-グルコシダーゼ / バイオマス / A. aculeatus |
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| Research Abstract |
１）セルロース結合ドメイン付与によるスーパーβ-グルコシダーゼの創製
セルロース結合ドメイン付与によるβ-グルコシダーゼの不溶性基質に対する活性への影響については今年度は行わなかった。昨年度に他機関との共同研究によりX線結晶構造解析によって立体構造が明らかとなったことから，当初の計画にはなかったが，活性中心付近のサブサイトを形成するアミノ酸置換によるセロビアーゼ活性の向上を試みた。そのために以下の戦略とたてた。i) セロオリゴ糖に対する活性を犠牲にしてもセロビオースに対する活性を向上させるためにサブサイト+2をふさぐことによりセロビオースの+1，+2サブサイトへの非生産的結合の防止，ii) サブサイト+1のグルコース残基との新たな水素結合形成，iii) サブサイト+1のグルコース残基とのスタッキング相互作用を示すY511を他の芳香族アミノ酸に置換。以上の15種類の変異BGL1をA. oryzaeを宿主とした大量発現系で大量生産し，精製酵素を用いてkinetic parameterを求めた結果，野生型酵素に比べて比活性の向上したものを得ることはできなかった。
２）進化分子工学的改変による各セルラーゼ成分の機能強化
β-グルコシダーゼの大腸菌を宿主とした発現が困難であったことから，今年度はすでに発現することが明らかとなっている酵母を宿主として遺伝子全長に対するランダム変異導入ライブラリを構築し，そこからグルコース，X-glcを含むプレート上で青コロニーを形成する形質転換体を分離したが，すべて野生型とアミノ酸配列が同じであったことから生産量の違いによるものと結論した。次に，立体構造から基質と相互作用する距離に存在する12種のアミノ酸すべてについてsaturation mutagenesisライブラリを構築し検索した結果IC50が大幅に向上した1株の変異体を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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