2011 Fiscal Year Annual Research Report
心筋転写因子の翻訳後就職と心臓発生におけるその役割
Project/Area Number |
22590803
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Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
廣井 透雄 東京大学, 医学部附属病院, 特任講師 (30311624)
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Keywords | Tbx5 / リン酸化 / DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / ANP |
Research Abstract |
心臓の転写因子であるTbx5の翻訳後修飾を明らかにするため、HEK293に過剰発現したFLAG-Tbx5によるプルダウンアッセイを行い、会合する蛋白としてリン酸化酵素(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit:DNA-PKcs)とその制御蛋白(Ku80)を同定した。Ku80はKu70とともにDNA-PKcsを制御するため、GST-Ku70,GST-Ku80と^<35>S-Tbx5のプルダウンアッセイを行ったところ、Ku80ではなく、Ku70が直接Tbx5に結合する可能性が考えられた。WeStern blotによっても、野生型TbX5とKU70,KU80,DNA-PKcsとTbX5の会合を確認することができた。Ku80は普遍的に発現しているが、マウスのin situ hybridizationでは、すべての組織が染色された。In vitroによる組換えDNA-PKcs蛋白によるリン酸化反応では、GSTと融合したTbx5の欠損変異蛋白は非特異的にリン酸化されてしまい、リン酸化候補部位を絞り込むことができなかった。そこで、DNA-PKのリン酸化コンセンサスシークエンスをTbx5で検索すると5カ所あったので、それぞれの部位をアラニンに置換した変異体を作成した。S289とS301はリン酸化が半分程度になり、S289/S301の二重変異体はほとんどリン酸化されなかった。DNA-PK阻害薬ではTbx5によるANP(600)-luciferaseの活性化は軽度抑制され、Ku70,Ku80,DNA-PKcsのcDNAによる強制発現により、活性化された。さらに、S289,S301変異体は野生型に比較し、ANPの活性化能、Nkx2-5との協調能が低下していた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Tbx5のリン酸化候補部位が2カ所あり、抗体作成が困難となった。 共同研究者が転勤となり、アフリカツメガエルの実験が困難となった。
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Strategy for Future Research Activity |
野生型、変異型Tbx5を発現するP19CL6細胞株の樹立を目指す。 Nkx2-5,Mef2cとTbx5を線維芽細胞に発現し、心筋細胞に分化させる系が発表されたので、その適応を考える。
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