2012 Fiscal Year Annual Research Report
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22770110
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
小森 博文 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (30382261)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | タンパク質複合体 / Ｘ線結晶構造解析 / 転写因子 |
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| Research Abstract |
RNAポリメラーゼIIによるDNA転写制御機構を明らかにするために、転写因子の構造をＸ線結晶解析によって決定することが最終的な目的である。これまでに、転写因子TFIIHサブ複合体（SSL1, TFB1, TFB2, TFB4）と転写因子TFIIEの精製を行った。TFIIHサブ複合体については、バキュロウイルスを利用して、昆虫細胞内で、４つのタンパク質（SSL1, TFB1, TFB2, TFB4）を共発現することで、サブ複合体を再構成した。Strep-tagを利用した精製により、サブ複合体の精製を行っているが、結晶化に適する試料の大量精製には至っていない。しかし、４つのタンパク質のなかで最も安定な複合体を形成するSSL1とTFB4を大腸菌内で共発現したところ、大量発現・精製することに成功した。転写因子TFIIEについては、TFIIEを構成する二つのタンパク質TFIIEalphaとTFIIEbetaを大腸菌内で共発現することにより大量発現し、グルタチオンカラムとNi-NTAカラムを利用したアフィニティークロマトグラフィーによ高純度に精製することに成功している。TFIIE単独あるいはDNA複合体の結晶化を現在進めている。さらに、鉄依存的に転写を制御する働きをする新たな酵母の転写因子Fep1-Grx4複合体の大腸菌発現系の構築を行った。今後、大量精製・結晶化を行い、その立体構造から転写制御のメカニズムを原子レベルで明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、DNA転写制御機構を明らかにするために、転写因子の構造をＸ線結晶解析によって決定することが最終目標である。そのためには、結晶化に適する標的タンパク質の大量精製が最も重要なステップである。これまでに、TFIIHの二つのタンパク質SSLとTFb4からなるタンパク質複合体とTFIIEの精製に成功している。さらに、新たな酵母の転写因子Fep1-Grx4複合体の発現系構築にも成功している。今後、これらのタンパク質複合体の結晶化・構造解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、DNA転写制御機構を明らかにするために、転写因子の構造をＸ線結晶解析によって決定することが最終目標である。これまでに、転写因子複合体試料を高純度に大量精製することに成功しているので、次の課題は、幅広い結晶化スクリーニングを進めて、X線回折実験に適する単結晶を得ることである。さらに、新たな酵母の転写因子Fep1-Grx4複合体の大量精製、結晶化も進める予定である。
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[Journal Article] Structural and enzymatic characterization of BacD, an L-amino acid dipeptide ligase from Bacillus subtilis.2012
Author(s)
Shomura Y, Hinokuchi E, Ikeda H, Senoo A, Takahashi Y, Saito J, Komori H, Shibata N, Yonetani Y, Higuchi Y.
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Journal Title
Protein Sci.
Volume: 21
Pages: 707-716
Peer Reviewed
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