2022 Fiscal Year Research-status Report
Partner selection of climbing fiber by Purkinje cell identity
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22K06457
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
金子 涼輔 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 准教授 (40390695)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 神経回路形成 / 小脳 / プロトカドヘリン / 遺伝子改変マウス / 脊髄小脳変性症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は申請者らの発見した「プルキンエ細胞個性」を足がかりとして、「登上線維が如何にして結合するプルキンエ細胞を選択するか？」に答える。
個々のプルキンエ細胞に結合する登上線維は1本のみである。この特異的結合はシナプス刈り込みを経て形成されるが、結合パートナーの選択メカニズムには不明な点が多い。申請者らは、クラスター型プロトカドヘリン(cPcdhα、β、γ。58種の多様化した細胞接着分子群)の、個々のプルキンエ細胞ごとに異なる組み合わせ発現を発見した。すなわち、個々のプルキンエ細胞にはcPcdh発現パターンの違いが作る「個性」がある。本研究では、このプルキンエ細胞個性の役割解明を目的として、プルキンエ細胞とそれに結合する登上線維におけるcPcdh発現パターンを明らかにする。
今年度は、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答えるための準備段階として、計画している課題a, b, cのうちの課題a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発を行った。58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhα2）を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスを開発する。本マウスは課題b, cに必須である。まず、内在性cPcdh遺伝子座への赤色蛍光タンパク質tdTomatoノックインにより、その発現を可視化可能なことを見出した。そこで、tdTomatoとCreER(薬剤誘導型Cre-loxP組換え酵素)とを内在性cPcdh遺伝子座へノックインするための準備を進めた。その結果、目的の遺伝子改変マウスが得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析。
現在までに、本研究遂行の上で必須となる、課題aが順調に進展している。具体的には、58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhb3）を発現する細胞を可視化可能なマウスの作製に成功している。さらに、cPcdhα2を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスの作製が順調に進展している。
さらに、当初の予定よりも早くに課題bおよび課題cを開始することができている。課題bでは、プルキンエ細胞ならびに下オリーブ核におけるcPcdhb3発現を、上記課題aにて作製したマウスにて可視化可能なことを見出した。また、課題cで用いる実験手法の予備的検討が順調に進展している。具体的には、登上線維を蛍光標識できる実験条件を見出した。すなわち、Cre依存的に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いる。このウイルスベクターを下オリーブ核へ投与する手法（針の長さ、挿入角度、挿入深さ）を精査し、安定して下オリーブ核へ投与できる条件を見出した。本手法にてウイルスベクターを下オリーブ核へ投与した小脳を観察したところ、登上線維が緑色蛍光を呈することを確認できた。
以上のように、当初の計画から前倒しで予定していた３課題全てを実施しており、いずれについても期待通りの結果が得られているため、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本研究で計画している３課題、a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析のうち、課題aに特に注力して進める。具体的には、これまでに得られている遺伝子改変マウスの交配を大規模に行うことで、目的に敵うマウス系統の特定ならびに繁殖を進める。目的のマウスが得られ次第、課題b、課題cを実施する。
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| Causes of Carryover |
実験条件の検討が当初の想定よりもスムーズに進んだため、それに要する費用の削減が可能であった。一方で、今後の解析を綿密に実施するためには多額の費用が必要となるため、次年度に使用する。
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