2023 Fiscal Year Research-status Report
シングルセル解析を用いたオートファジー依存型結石抑制遺伝子の同定
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22K09508
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
海野 怜 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40755683)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 和己 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (00595184)
安藤 亮介 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (30381867)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
岡田 淳志 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70444966)
杉野 輝明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (70881746)
濱本 周造 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (80551267)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | オートファジー / 尿路結石 / RNA sequencing |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジー活性を調べるために、tandem fluorescent-tagged LC3 (tfLC3) を48時間transfectionしたHK2細胞(5x104個/well)に対して、CaOx1水和物(COM)結晶を1, 10, 20, 40μg/cm2の濃度で、2, 6, 12, 24, 48時間暴露させた。細胞を回収後、細胞を単離・溶解し、mRNAをバーコードを付加したビーズとハイブリダイズさせる。逆転写反応を行い、バーコード配列を有したcDNAを作成、増幅させ、library準備を行い、sequencingを行った。
オートファジーの活性を、共焦点顕微鏡によるGFP-RFP-MAP1LC3シグナルの観察で評価したところ結晶負荷により有意にオートーファジーが低下した。さらにシークエンス結果を、発現差異解析 (Differential expression gene analysis: DEGA): scanpy softwareのrank_genes_group moduleを使い群間の遺伝子発現の差を計算したところ、結晶負荷した群においてはMIFやIL6、さらには炎症性マクロファージに代表される炎症の遺伝子が有意に上昇していた。つぎに、擬時系列解析 (Pseudotime analysis)によって、主成分分析(PCA)による次元削減後の発現プロファイルの類似度に基づいて推定された軸に沿って細胞を配置し、細胞間で起点となる群から終点となる群を同定したところ、これら炎症系の遺伝子をマーカーとする細胞集団群が起点となる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroの研究は計画通り進んでいる。ヒト検体の結果は、現在解析中であり、そちらも順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
解析を進めていく
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| Causes of Carryover |
現在sequencingを行なっているところであり、今後追加のシークエンス費用や解析費用、結果を利用したオルガノイド作成費用などがかかる。
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