Suppression of Hedgehog signaling pathway modulate Schwann cell function

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K10116
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 佐藤 由美子 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任助教 (70709857)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 友里恵 (山田友里恵) 新潟大学, 医歯学系, 助教 (20804537) ; 前田 健康 新潟大学, 医歯学系, 教授 (40183941) ; 瀬尾 憲司 新潟大学, 医歯学系, 教授 (40242440)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 神経再生 / 末梢神経 / ヘッジホッグシグナル / シュワン細胞 / Gli1

Outline of Annual Research Achievements

正常末梢神経および損傷末梢神経のパブリックシングルセルRNAseqのデータを解析し、Hedgehogシグナル関連分子（Dhh, Shh, Gli1, Gli2, Gli3, Smo）を発現している細胞、およびその遺伝子発現変動を解析した。すると、線維芽細胞が損傷神経においてHedgehogシグナルが活性化していることが分かった。そこでGli1を発現する線維芽細胞の分布を観察するために、ヘッジホッグシグナルの活性マーカーであるGli1特異的に緑色蛍光蛋白を発現するマウス (Gli1creER R26RYFPマウス)の正常神経を確認した。Gli1を発現する線維芽細胞は神経の周膜を構成する細胞と、内鞘の血管に付随する細胞、付随しない細胞の３種類に分類できることがわかった。Gli1creER R26RYFPマウスの神経を損傷し、損傷後１、３、５、７、１４、２８日に損傷神経を摘出し観察したところ、Gli1陽性細胞が損傷神経断端で増殖し、損傷部に集まっていることがわかった。前述した３種類の細胞のいずれが増殖しているかを確認するために、Gli1陽性細胞が最も増殖する損傷３日後の神経を血管内皮細胞マーカーのCD31抗体で染色した。すると、血管周囲のGli1陽性細胞が増殖していることが分かった。Gli1陽性細胞の増殖の経時的変化ををKi67抗体の免疫染色で確認したところ、Gli1陽性細胞は損傷後１〜３日にかけて増加し、７日以降はほぼ増殖していないことが分かった。血管周囲のGli1陽性細胞は、正常神経ではNG 2, PDGFRβ, αSMAを発現していたが、損傷神経ではαSMAの発現を失っていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Gli1creER R26RYFPマウスの損傷神経の観察により、ヘッジホッグシグナル活性を持った細胞の損傷神経における動態変化を解析することができたため。

Strategy for Future Research Activity

当初の研究計画に則した実験を行う。Gli1陽性細胞の損傷神経におけるより詳細な細胞動体を観察するために、Gli1creER R26RYFPマウスの損傷神経をホールサンプルで解析する。サンプルは透明化し、共焦点顕微鏡で観察する。共焦点顕微鏡でサンプル深部の観察が困難な場合は、多光子顕微鏡を用いた観察を検討する。また、ヘッジホッグシグナルのリガンドであるsonic hedgehogを分泌するシュワン細胞とGli1陽性細胞の相互作用を検討するために、シュワン細胞特異的に蛍光タンパクを発現するマウス（MPZ-tomatoマウス）を作成し、Gli1creER R26RYFPと交配しGli1creER R26RYFP MPZ-tomatoマウスを得る。同マウスの神経を損傷し、シュワン細胞とGli1陽性細胞の分布および位置関係を確認する。

Causes of Carryover

既存の薬品や器材を使用することで消耗物品の購入が抑えられたため次年度使用額が生じた。今後は蛍光タンパク発現マウスの作製にあたり必要な薬品、物品の購入に充てる予定である。