ＨＢｐ１７／ＦＧＦＢＰノックアウトによる扁平上皮細胞の分化誘導メカニズムの解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K10147
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 新谷 智章 広島大学, 病院(歯), 講師 (90403518)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 哲治 東亜大学, その他の研究科, 教授 (00169153) ; 檜垣 美雷 広島大学, 病院(歯), 助教 (40826856) ; 林堂 安貴 広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 遺伝子編集

Outline of Annual Research Achievements

Heparin-binding protein 17/FGF-Binding Protein (HBp17/FGFBP)は、研究分担者の岡本らが、A431細胞の培養上清よりFGF-2とともに分離・精製した、ヘパリン親和性分泌蛋白であり、上皮細胞で特異的に発現していた（Wu DQ et. al. J Biol Chem. 1991）。造腫瘍性を欠失しHBp17/FGFBP遺伝子を発現していないA431の亜株である#4クローンにHBp17/FGFBPを発現させると、in vitroでの増殖能はA431#4細胞に比べ著しく亢進し、ヌードマウス背部皮下における造腫瘍性を獲得したED-71もしくはエタノールを添加したA431細胞の培養上清中のexosomeに含まれるmicroRNA (miRNA)をそれぞれ抽出後、miRNAマイクロアレイ解析にてmiRNA発現の網羅的解析を行なった。HBp17/FGFBP mRNAを標的とするmiR候補を検索した結果、ED-71により発現が上昇するexosomal miRNAとして、miR-6887-5pを同定した。miR-6887-5p mimicを用いてmiR-6887-5pを過剰発現させたSCC/OSCC細胞では、コントロールと比較してHBp17/FGFBP-1の発現抑制を認めた。miR-6887-5p mimicを導入したSCC/OSCC細胞ではコントロールに比べin vitro/in vivoにおける有意な増殖抑制効果を認めた。CRISPR／CASシステムを用いて、A431細胞のHBp17/FGFBP遺伝子発現をノックアウトした、A431ーHBp17KO細胞を構築した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

CRISPR／CASシステムを用いて、A431細胞のHBp17/FGFBP遺伝子発現をノックアウトした、A431ーHBp17KO細胞を構築したが、A431細胞への遺伝子導入効率が悪く、リポフェクション法だけでなくエレクトロポレーション法も試したために時間を予定より多く要した。

Strategy for Future Research Activity

A431ーHBp17KO細胞とParent細胞から蛋白とRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ法とプロテオミクスによるアッセイを行い、2つの細胞の遺伝子と蛋白の発現の違いを確認する。

Causes of Carryover

初年度に遺伝子導入に時間を要したために全体的に実験の進捗が遅れているため、次年度使用が生じた。次年度はA431KO細胞のキャラクターを調べるために、タンパクとmRNAを抽出し、プロテオミクスやマイクロアレイを行う。