Exploration for exosome-borne signal transduction during alveolar bone remodeling under orthodontic force application

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K10256
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 新井 千博 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (10460221)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠山 俊之介 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (10908940) ; 和田 悟史 鶴見大学, 歯学部, 助教 (20581119) ; 菅崎 弘幸 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (30333826) ; 勝又 裕太 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (70886423) ; 石川 美佐緒 鶴見大学, 歯学部, 講師 (90582445)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: エクソソーム / miRNA / メカニカルストレス / 歯周組織 / 骨代謝

Outline of Annual Research Achievements

矯正治療では、歯根膜圧迫側での骨吸収と歯根膜伸展側での骨形成という部位特異的な骨代謝の変化によって矯正学的歯の移動が起こる。この部位特異的な骨代謝の変化は矯正力というメカニカルストレスによって惹起され、その感受機構に関する研究が行われてきた。歯槽骨骨細胞が矯正力を感受しRANKL産生に重要な役割を果たすとする報告がある。しかしながら臨床的に歯根膜が無い骨性癒着歯では歯の移動が起こらないことから、メカニカルストレス感受にPDL細胞が重要な役割を果たしていると考えられる。近年遠隔標的細胞への情報伝達機構としてエクソソーム分泌を介した系がガンの分野を中心に解析が進んでいる。しかしながら矯正力のようなメカニカルストレスと歯周組織骨代謝との関連にエクソソームがどのような役割を果たしているかは報告されていない。本研究課題では圧迫刺激・伸展刺激などメカニカルストレスを受けたPDL細胞は異なるmicroRNAで構成されたエクソームを分泌し、伸展刺激エクソソームは骨芽細胞の骨形成を促進し、圧迫刺激エクソソームは破骨細胞分化を促進する、と仮説を立て、その検証を動物実験系、および細胞培養実験系で解明することを目的として研究を行った。
培養実験系において、ヒトPDL細胞のコントロールおよび伸展刺激エクソソームのmiRNAプロファイル比較を行った。その結果として、次のようなmiRNA について発現に差が見られた。（hsa-miR-4755-3p, hsa-miR-4718, hsa-miR-4663, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-1246）さらにPDL細胞のコントロール・伸展刺激エクソソームを精製し、ヒト骨芽細胞株MG-63培養系へ添加したところ、伸展刺激エクソソームによって骨芽細胞マーカーであるALPやOCNの発現上昇が観察された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初研究計画では、具体的には下記の3点を明らかにすることを目的としていた。
1) 圧迫刺激・伸展刺激エクソソームに含まれるmiRNAプロファイリング
2) 伸展刺激エクソソームを介した骨芽細胞分化促進機構
3) 圧迫刺激エクソソームを介した破骨細胞分化促進機構
これらのうち、1)についてはデータを取得することができ、各メカニカルストレスで異なるmiRNAを含有したエクソソームが分泌されることをつかんでいるため、計画はおおむね順調に進展していると自己評価している。

Strategy for Future Research Activity

計画のうち、
2) 伸展刺激エクソソームを介した骨芽細胞分化促進機構
3) 圧迫刺激エクソソームを介した破骨細胞分化促進機構
についてはまだ解析を行っている途中である。これらを明らかにすべく研究を遂行する。

Causes of Carryover

研究計画はおおむね順調に進展してはいるが、研究代表者および分担者とも外来診療・教育に時間が割かれ研究を進めるのに十分な時間を割くことが難しかったため次年度使用額が生じた。
計画として、伸展刺激エクソソームを精製し、ヒト骨芽細胞セルライン培養系に添加し、骨芽細胞分化への影響を調べる。すなわちRNAサンプルからリアルタイムRT-PCRにて骨芽細胞分化マーカーについて遺伝子発現解析、タンパクサンプルからwestern blotting解析を行い、ALP染色、アリザリンレッド染色（石灰化検出）を行う。その後、1)で伸展刺激特異的に変動するmiRNA群について骨芽細胞分化因子を標的とするものを、miRBaseやTargetScanのデータベースを用いてin silicoで解析を行い、候補miRNAを絞り込む。これらmiRNAについてgain of function, loss of functionを行い、骨芽細胞分化への影響を調べることで伸展刺激エクソソームを介した骨芽細胞分化促進機構を解明する。