2023 Fiscal Year Research-status Report
Functions of the cholangiocarcinoma suppressor gene extracted from printing company workers' samples: From cell cycle regulation to drug discovery
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22K10491
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
川村 悦史 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (60419710)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松原 勤 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698)
湯川 博 名古屋大学, 未来社会創造機構, 特任教授 (30634646)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 肝内胆管癌 / 胆管細胞癌 / 職業性胆管癌 / 印刷所 / ジクロロプロパン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、地元大阪市の印刷会社で使われた1,2-ジクロロプロパン(労災認定)による胆管癌発症の事例(2012年)をきっかけに同疾患の遺伝子発現に注目した。2015年度、 我々は同印刷会社症例を含む胆管癌の外科的切除腫瘍組織を用いてRNA発現異常の探索を開始した(JSPS科研費No. 15K08716)。24例の肝胆道系腫瘍(胆管癌10例、対照として肝細胞癌10例、良性胆道腫瘍4例)の検体(組織及び血清)からRNA抽出液を得て、micro RNA(miR)、messenger RNA(mRNA)に対する 高感度マイクロアレイ解析を行なった。2016年度、胆管癌と他の腫瘍を区別し得るmiR20種を抽出した。更にweb上の標的データベースにより、癌抑制遺伝子SKI (Sloan-Kettering Instituteが発見したタンパク) mRNAおよびmiR-3648を抽出した。2019年度以降、我々はSKIの胆管癌増殖抑制能の解析を進め(同No. 19K10604)、SKI-p21シグナルを発見した(SKIが細胞周期のブレーキ役p21の発現を高める)。2022年、我々はこの成果を欧州生化学会速報誌に発表し、国際学会であるアジア太平洋肝臓学会APASL oncologyにおいてinvestigator awardを受賞した(同No.22K10491)。2023年以降、3つの実験が進行中である。1つ目は、SKIのタンパク構造のうちp21 DNAの転写に関わるアミノ酸配列の特定、2つ目は、SKIが関わるp21-DNAの転写に介在するタンパクの探索(SKIタンパクのうちp21転写に関わるアミノ酸配列を特定)、3つ目は、胆管癌モデルマウスの作成(現在、化学曝露による前癌状態誘導に成功)である。以上、我々は胆管癌の新たな創薬を念頭に、癌抑制遺伝子の機能解析を続け、着実に成果を得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2015年度以降、我々は3つのJSPS科研費の助成(No. 15K08716、No.19K10604、No.22K10491)により我々の地元大阪市で発生した化学物質（ジクロロプロパン等）による職業性胆管癌症例を含む臨床検体を対象として、(1)胆管癌の進行と関わる遺伝子の探索(高感度RNAマイクロアレイによる網羅的解析)、(2)(1)の結果のうち化学物質の代謝酵素と関連するRNAの定量的解析(職業性胆管癌の発症機序の推定)、(3)(1)の結果、抽出された100種類を超えるRNAデータ(microRNAおよびこれらが制御するmRNA)を遺伝子発現情報データベース（米国国立生物工学情報センター）に登録した上で主成分解析（共同研究者がプログラムしたGitHubアルゴリズム）により胆管癌関連遺伝子を選別した。(1)-(3)により、代謝酵素と関連する遺伝子発現異常は特定されなかった。しかし、選別した遺伝子のうち消化器癌と関連しうるものに注目しヒト胆管癌細胞株による実験を行ない、SKIタンパクがp21（SKIにより発現上昇し細胞周期G1で抑制）DNAの転写を介して胆管癌の増殖を抑制することを発見した（論文発表済）。現在、我々はSKI-p21シグナルの胆管癌増殖抑制における機能の解析を続けている［(i)-(iii)実施中］：(i)SKIがp21 DNAの転写に関わる鍵となるアミノ酸配列の特定に成功（同配列を欠損させた"SKIデルタ"プラスミドを合成し、SKI全長との比較解析中）、(ii)SKIがp21-DNAの転写を促進する際に介在するタンパクの探索（免疫沈降反応で検出された候補タンパクを解析中）、(iii)胆管癌モデルマウスの作成（現在、我々は化学曝露による胆管癌の前癌状態の誘導に成功）。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は、2021年度中にSKIがヒト胆管癌細胞の増殖を抑制する事を示す基礎データを得て2022年、学外へ発信した（国際学会と欧州生化学会の速報誌にて発表済）。この抑制は、同遺伝子が細胞周期のブレーキ役であるp21タンパクの発現を亢進すること(定量的なmRNA PCRとwestern blotで検証)、及びSKIタンパクがp21 DNAの転写に関わっていること(レポーターアッセイで検証)、によると考えられた。我々は、2024年以降、ここまでの成果（ヒト胆管癌細胞株におけるSKI-p21シグナルの増殖抑制能）を発展させる。具体的な方策は次の通りである。（1）SKIのアミノ酸構造のうちp21転写に関連する配列の特定（SKIタンパクの全長から数百のアミノ酸構造ずつ短縮したプラスミドを複数設計し細胞導入しp21発現促進がみられる構造とみられない構造の違いを突き止める）、（2）SKIがp21-DNAの転写を促進する際に介在するタンパクの特定（免疫沈降法と近接依存性標識法を併用し候補タンパクを絞り込む）、（3）胆管癌動物モデルの樹立（現在、成功している化学曝露による前癌状態の誘導を"Ski欠損マウス"に対して実施したい）。（1）-（3）によりSKIが胆管癌の増殖や発生に与える影響を明らかにし、本疾患の創薬基盤になることを目指す。
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| Causes of Carryover |
我々は胆管癌の病態進行に関する基礎的解析に取り組み、SKI-p21シグナルが胆管癌の増殖を抑制するとの成果を得た（解析継続中）。一方、今年度は予定通り進まない点もあった。その一因は、本研究の代表者である川村は2019年度以降、大阪公立大学医学部附属病院の常勤臨床医として診療に従事している。特に2023年5月の新型コロナ5類移行前までは感染対策マネージャーを兼務した。大阪市内のコロナ感染の拡大は国内有数であり、研究活動は一時中断、同5月以降、徐々に研究を再開した。コロナ禍により 研究時間の短縮や海外から納入する試薬の航空便の遅延もあり、十分に解析ができず次年度使用額が生じた。次年度、我々は同シグナルの抗癌作用に関する解析(1)-(3)を継続し、成果がこの疾患の創薬の基盤となることを目指す [(1)p21 DNAの転写に関わる鍵となるSKIタンパクのアミノ酸配列の機能の検証：合成済の同配列を欠損させた"SKIデルタ"プラスミドとSKIプラスミド（全長）との比較解析、(2)SKIのp21-DNA転写に介在するタンパクの探索：実施済の免疫沈降法に近接依存性標識法を組合せた候補タンパクの絞り込み、(3)胆管癌モデルマウスの作成：実施済の化学曝露胆管癌モデルにおけるSkiの発癌への影響の解析(Ski欠損マウスの作成)]。次年度使用額は、解析(1)-(3)の経費に充てたい。
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[Presentation] Exploring genes involved in proliferation of intrahepatic cholangiocarcinoma using clinical samples2024
Author(s)
Etsushi Kawamura, Tsutomu Matsubara, Masaru Enomoto, Kazuo Ikeda, Naoshi Odagiri, Norifumi Kawada, Kohei Kotani, Atsuko Daikoku, Chiho Kadono, Hideto Yuasa, Ritsuzo Kozuka, Atsushi Hagihara, Hideki Fujii, Sawako Uchida-Kobayashi, Takeshi Izawa
Organizer
アジア太平洋肝臓学会(The 33rd Annual Meeting of the Asian Pacific Association for the Study of the Liver)
Int'l Joint Research
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