2022 Fiscal Year Research-status Report
アルボウイルスの特殊なゲノムRNA構造の解析と媒介性の規定要因としての検証
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22K19185
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
大手 学 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (20386717)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
嘉糠 洋陸 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50342770)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Keywords | ヤブカ / デングウイルス / フロックハウスウイルス / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が発見したプラス鎖RNAウイルスに誘導される特殊なRNA構造について、その詳細を明らかにすることを目的とした。この構造を認識する抗体を用いた細胞染色により、デングウイルスの複製サイトに局在するRNAがこの構造を形成することがわかった。また、昆虫ウイルスの変異解析を行うために、FHVのTrans-replication systemを開発した。ウイルスゲノムと複製酵素をそれぞれプラスミドにクローニングし、培養細胞に導入したところ、複製が確認された。特に、プラスミド導入後2日に転写阻害剤を添加すると、複製がより活発になることがわかった。また、ウイルスの複製に必要な約250塩基のゲノムRNA領域を特定し、変異解析を行った。ゲノム配列の情報解析により、分子内構造を形成することが予想された配列に変異を導入したところ、影響がみられなかった。そこで、網羅的な変異解析を行ったところ、複数のウイルスRNA分子が相互作用している可能性が示された。このシステムでは任意の配列を導入することができることができる。そこで、担体結合性アプタマーを挿入することにより、細胞内よりウイルスRNAを高純度で生成する手法を開発した。これにより、ウイルスRNAを1-2万倍濃縮することができた。この手法によって精製したウイルスRNAを用いてin vitro解析を行ったところ、RdRPにより、ウイルスRNA自体の性質が変化していることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウイルスRNAの構造の詳細を解析する手法を複数確立することができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
FHVにより得られた知見をもとに、デングウイルスRNAに形成される構造の解析を行う。担体結合性アプタマーを用いたRNA精製が可能であることが判明したため、レプリコンにアプタマーを挿入したコンストラクトを作成し、詳細な解析を行う。
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| Causes of Carryover |
RNAの2次構造を解析する予定であったが、当初の予想に反し、RNAが修飾されている可能性が生じた。重要な発見であるため、まずはRNA修飾を解析する実験を行い、2次構造解析は次年度行うこととした。
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