2013 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子破壊細胞を使った、化学物質の生物効果をハイスループットに解析するシステム
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23221005
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
武田 俊一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60188191)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣田 耕志 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (00342840)
山田 亮 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50301106)
岡田 徹也 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (70378529)
笹沼 博之 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00531691)
清水 宏泰 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (60340551)
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| Project Period (FY) |
2011-05-31 – 2016-03-31
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| Keywords | 有害化学物質 / ハイスループットスクリーニング / 遺伝毒物学 / 発がん物質 / 変異原 |
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| Research Abstract |
化審法で定められた、化学物質の変異原性（発がん性）を検出するバイオアッセイは、正常細胞（野生型）のみを使っている。この手法は特異性に問題がある。この問題を克服する為に、野生型のみならず、その野生型から創ったDNA修復酵素遺伝子破壊株も使い、両者の、化学物質に対する応答を比較するべきであるというのが我々の提案である。この手法では、野生型のデータを陰性対照に使うことによって、変異原性解析の特異性を保証できる。
我々は、新規に変異原検出手法を開発するため、2種類のDNA修復酵素遺伝子破壊株、Polζ-/-とKU70-/-/RAD54-/- 細胞を選んだ。H25年度には、これらの遺伝子破壊株と野生型株の合計3種類のDT40細胞を米国National Institute of Health (NIH)において、National Toxicology Program (NTP) PhaseII chemical library（11,000種類）に曝露した。曝露の時の化学物質の濃度は7点（5桁の範囲）、曝露時間は40時間、曝露後に細胞抽出液中のATP量（生細胞数測定の代わり）を測る。よって1回の曝露実験は、約22万（3×11,000種類×7）ものデータから成る。このデータを基に、現在確認実験を米国で遂行中である。
意義と重要性は、以下のとおりである。我々の有害性試験は、有害性を遺伝学的に定義するのが特徴である。例えば、仮に、ある化学物質がPolζ-/-細胞に対して野生型よりも強い毒性を発揮すれば、その毒性はPolζの機能と関連すると断言できる。すなわち当該化学物質がPolζが修復するタイプのDNA損傷を作っていると推定できる。我々が提案する有害性試験は、各タンパクの学問的研究成果が毒性解析にそのまま生かせる合理的な解析方法である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
（１）新規変異原検出手法の開発
我々が提案した変異原性解析手法の妥当性を検証する為に、NTP PhaseII chemical libraryの曝露実験を行えた。
（２）小胞体ストレスの原因になる化学物質の検出手法の開発
京大理・岡田助教らは、ニワトリDT40細胞、ヒトTK6細胞を使って、小胞体ストレスの原因になる化学物質を検出するバイオアッセイを創った。それらを米国NIHに持ち込んで、その感度を定量した。米国NIHは、企業と共同して、同じ目的のバイオアッセイを企業と共同して既に樹立していた（ヒトHaLa細胞を利用）。ヒトTK6細胞を利用したバイオアッセイは、ヒトHaLa細胞を利用したバイオアッセイよりも感度が良いことが判った。
（３）ヒト体細胞株で遺伝子破壊
CRISPRやTALENが開発され、ヒト体細胞株で遺伝子破壊が可能になった。化審法で変異原性検出に使われるヒト細胞でも遺伝子破壊ができることが確認できた。従来の化審法の検出手法では、正常（野生型）細胞（ヒトTK6 Bリンパ細胞株）が使われてきた。我々がそのTK6細胞株で遺伝子破壊を行うことによって、化審法で採用されている変異原性試験の感度及び特異性を大きく上昇できるめどがついた。実際に上昇できるかどうかは、米国National Toxicology Programおよびと国立医薬品食品変異衛生研究所の遺伝部長 本間正充 博士と共同して検証できる。国内のみならず、欧米の政府でも使用されているTK6細胞株から遺伝子破壊ができるようになって、我々が作製するミュータントが行政において実際に将来利用される可能性が大きく高まった。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）新規変異原検出手法の開発
NTP PhaseII chemical libraryの曝露実験を行えた。この結果、偽陽性の可能性があるデータと偽陰性のデータが得られた。偽陽性については、むしろ真に陽性である、すなわち既存の変異原性解析手法の陰性データが間違っていた可能性を検証する。その為にDNA修復酵素の欠損株において染色体試験を行う。偽陰性については、我々が提案した変異原性解析手法の感度を高める方策（例、試薬と細胞の曝露時間を延長）を検討する。
（２）小胞体ストレスの原因になる化学物質の検出手法の開発
京大理・岡田助教らが開発した、ヒトTK6細胞を利用したバイオアッセイは、National Toxicology Program Phase II chemical library (11,000種類) を使って、その妥当性を検定してもらうことになった。この検定結果は、2年後には出る。
（３）既存の変異原検出手法の改良
規制に使うバイオアッセイは、全く新規のものを開発するよりも、既存のバイオアッセイを改善する方がはるかに現実的である。その理由は、企業は有害性の可能性が宣告された化学物質を市場に出すことができず、偽陽性の実験結果が出ると企業は多大な損害を被るからである。したがって、新規のバイオアッセイは、その有効性が完璧に証明されない限り、企業の反対を押し切ってまで導入することは困難だからである。我々は、化審法により小核テストで使われているヒトTK6細胞株で遺伝子破壊を行い、既にDNA修復酵素の欠損株を複数種類作製した。このミュータントを使うことによって、小核テストの感度と特異性を実際に上昇できるか否かを、米国National Toxicology Programおよびと国立医薬品食品変異衛生研究所の遺伝部長 本間正充 博士と共同して検証する。
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[Journal Article] Histone deacetylase inhibitors selectively target homology dependent DNA repair defective cells and elevate non-homologous endjoining activity.2014
Author(s)
Smith S, Fox J, Mejia M, Ruangpradit W, Saberi A, Kim S, Choi Y, Oh S, Wang Y, Choi K, Li L, Hendrickson EA, Takeda S, Muller M, Myung K
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e87203
DOI
Peer Reviewed
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