2014 Fiscal Year Annual Research Report
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23246142
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
松岡 英明 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10143653)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斉藤 美佳子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20291346)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 胚性幹細胞 / 未分化状態 / 遺伝子発現動的制御 / フェムトインジェクション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、マウスES細胞の未分化維持に関わる主要な転写因子、Oct3/4、Sox2、Cdx2、Nanogに着目し、①転写因子-EGFPの強制発現ベクターの開発、②転写因子に対する発現抑制遺伝子(shRNA)-EGFPの強制発現ベクターの開発、③転写因子タンパク質の開発、④プロモーター活性可視化ベクターの開発、⑤プロモーター活性可視化細胞株の開発、⑥開発した細胞株への①～③の直接導入と、それに伴う、転写因子発現の動的解析、の実施を目的としている。
本年度は、昨年度までに十分実施できなかった②、④を実施した。すなわち、②として特にOct3/4に対するshRNAを検討した。4種類の候補配列からコントロールに対して50％以下にノックダウンできる最適配列を選び、これをEGFPと共に組み込んだベクターを作製した。また、④としてはこれまで滞っていたCdx2のプロモーターのクローニングを成功させ、これを導入した細胞株の開発にも成功した。そこで、⑥としてフェムトインジェクションいより、次の3例を実施した。
①の例として、Cdx2-EGFP強制発現ベクターをNanog-Venus細胞へ導入した。51個中、EGFPを発現した細胞は1個のみであったが、その細胞ではVenus蛍光強度は弱く72時間でコロニー形状も不定形の分化した状態になった。②の例では、shOct3/4-EGFP強制発現ベクターをOct3/4-Venus細胞に導入した。導入後、48時間まではVenus蛍光強度が増大したが、その後72時間後までに蛍光強度が急激に減少する事例が観測できた。③の例では、Oct3/4タンパクをOct3/4-Venus細胞に導入した。Venus蛍光強度が、導入後3時間以内に減少することが観察された。高濃度のOct3/4タンパクによるOct3/4遺伝子発現のフィードバック阻害であると推定された。各々事例は少ないが、目的とする単一ES細胞遺伝子発現解析のためのプラットフォームが構築できたと考えられる。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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