長鎖非コード（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ遺伝子トラップマウスを用いた個体レベルの機能解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23310135
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (90211705)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 遺伝子トラップ / 非コードRNA / X-gal染色 / 変異マウス

Research Abstract

我々は、可変型遺伝子トラップにより単離したトラップESクローンの中で、2009年Guttmanらによって発表された Large intervening non-coding RNA (lincRNA)をトラップしている13クローンを選び、解析を進めている。
X-gal染色による発現解析では、13系統中11系統で染色が認められ、染色は弱いものの、組織特異的発現を示すものが多かった。今まで、同じベクターで得られたタンパクコード遺伝子をトラップしたラインでは8割以上でユビキタスかそれに近い発現が得られていたことと比べると明らかに異なる傾向を示す。
ヘテロ接合体同士の交配を行い、ホモ接合体が離乳まで生存するかどうか検討したところ、12系統では正常な割合でホモ接合体が得られた。１系統ではホモ接合体の割合が5%と低かったので、12.5日胚で調べたところ、やはりホモ接合体の割合は3%と低く、もっと早期に致死になっている可能性がある。
13系統のうち、ゲノムブラウザでlincRNA遺伝子と定義づけられている4系統について、トラップベクター挿入によりヌル変異になっているかどうかをRT-PCRで検討した。その結果、４系統全てでトラップアレルはヌルアレルとなっていることが分った。また、X-gal染色では組織特異的発現であったが、RT-PCRでは全ての組織で弱いながらも発現していることも明らかになった。詳しく表現型解析を行うため、10週齢までの体重曲線と、10週齢での血液生化学検査を行ったが、ホモ接合体に顕著な変化は見られなかった。
そこで、過剰発現による効果を検証するため、２系統についてはcDNA全長をCAGプロモーターで過剰発現させるコンストラクトを作製、可変型遺伝子トラップの特長を生かし、トラップベクターが挿入されている場所に発現ベクターをノックイン、マウスラインを作製した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

挿入部位、X-gal染色による発現解析、ヘテロ接合体同士の交配による胚性致死の有無、という1次スクリーニングは終了し、重点的に解析を行う系統を４つに絞り込むことが出来た。それらについては、体重曲線や血液生化学検査も行った。また、２系統については、過剰発現の効果も調べるために、その遺伝子座へ過剰発現ベクターをノックインしたマウスも作製した。

Strategy for Future Research Activity

胚性致死の可能性のある１系統については、胚性12.5日以前にさかのぼり、ホモ接合体が致死になる時期を明らかにする。目立った表現型が確認されなかった３系統については、発現している組織に負荷を与えることで表現型が現れないか検討する。また、作製した過剰発現マウスを用い、もとのトラップマウスラインと表現型に変化が現れるかどうか検討する。

Research Products

• [Journal Article] The kick-in system: a novel rapid knock-in strategy. (2014)
  • Author(s): Tomonoh, Y., Deshimaru, M., Araki, K., Miyazaki, Y., Arasaki, T., Tanaka, Y., Kitamura, H., Mori, F., Wakabayashi, K., Yamashita, S., Saito, R., Itoh, M., Uchida, T., Yamada, J., Migita, K., Ueno, S., Kitaura, H., Kakita, A., Lossin, C., Takano, Y., Hirose, S.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 9 Pages: e88549
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0088549.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation and analysis of serine protease inhibitor kazal type 3-cre driver mice. (2014)
  • Author(s): Sakata, K., Ohmuraya, M., Araki, K., Suzuki, C., Ida, S., Hashimoto, D., Wang, J., Uchiyama, Y., Baba, H. and Yamamura, K.
  • Journal Title: Exp. Anim. Volume: 63 Pages: 45-53
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Screening Methods to Identify TALEN-Mediated Knockout Mice. (2014)
  • Author(s): Nakagawa, Y., Yamamoto, T., Suzuki, K., Araki, K., Takeda, N., Ohmuraya, M. and Sakuma, T.
  • Journal Title: Exp. Anim. Volume: 63 Pages: 79-84
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autophagy regulation in pancreatic acinar cells is independent of epidermal growth factor receptor signaling. (2014)
  • Author(s): Ozaki, N., Fukuchi, Y., Tomiyoshi, S. R., Uehara, H., Ida, S., Wang, J., Araki, K., Sibilia, M., Baba, H., Yamamura, K. I. and Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 446 Pages: 224-230
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.02.111.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ectopic Expression of Ptf1a Induces Spinal Defects, Urogenital Defects, and Anorectal Malformations in Danforth’s Short Tail Mice. (2013)
  • Author(s): Semba, K., Araki, K., Matsumoto, K., Suda, H., Ando, T., Sei, A., Mizuta, H., Takagi, K., Nakahara, M., Muta, M., Yamada, G., Nakagata, N., Iida, A., Ikegawa, S., Nakamura, Y., Araki, M., Abe, K. and Yamamura, K.
  • Journal Title: Plos Genet. Volume: 9 Pages: e1003204
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003204
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Perivascular adipose tissue-secreted angiopoietin-like protein2 (Angptl2) accelerates neointimal hyperplasia after endovascular injury. (2013)
  • Author(s): Tian, Z., Miyata, K., Tazume, H., Sakauguchi, H., Kadomatsu, T., Horio, E., Takahashi, O., Komohara, Y., Araki, K., Hirata, Y., Tabata, M., Takanashi, S., Takeya, M., Hao, H., Shimabukuro, M., Sata, M., Kawasuji, M. and Oike, Y.
  • Journal Title: J. Mol. Cell. Cardiol. Volume: 57 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2013.01.004.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gene trap mutagenesis using Mol/MSM-1 ES cells established from MSM/Ms strain. (2013)
  • Author(s): Nakahara, M., Tateyama, H., Araki, M., Nakagata, M., Yamamura, K. and Araki, K.
  • Journal Title: Mamm. Genome. Volume: 24 Pages: 228-239
  • DOI: 10.1007/s00335-013-9452-4.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of CD99 with its paralog CD99L2 positively regulates CD99L2 trafficking to cell surfaces. (2013)
  • Author(s): Nam, G., Lee, Y. K., Lee, H. Y., Ma, M. J., Araki, M., Araki, K., Lee, S., Lee, I. S. and Choi, E. Y.
  • Journal Title: J. Immunol. Volume: 191 Pages: 5730-5742
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1203062.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HOT1 is a mammalian direct telomere repeat-binding protein contributing to telomerase recruitment. (2013)
  • Author(s): Kappei, D., Butter, F., Benda, C., Scheibe, M., Draskovic, I., Stevense, M., Novo, C.L., Basquin, C., Araki, M., Araki, K., Krastev, D.B., Kittler, R., Jessberger, R., Londono-Vallejo, J.A., Mann, M. and Buchholz, F.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 32 Pages: 1681-1701
  • DOI: 10.1038/emboj.2013.105.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TASK-2: a K2P K(+) channel with complex regulation and diverse physiological functions. (2013)
  • Author(s): Cid, L. P., Roa-Rojas, H. A., Niemeyer, M. I., Gonzalez, W., Araki, M., Araki, K. and Sepulveda, F. V.
  • Journal Title: Front Physiol. Volume: 4 Pages: 198
  • DOI: 10.3389/fphys.2013.00198
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for in vitro fertilization. (2013)
  • Author(s): Nakagata, N., Takeo, T., Fukumoto, K., Kondo, T., Haruguchi, Y., Takeshita, Y., Nakamuta, Y.,, Matsunaga, H., Tsuchiyama, S., Ishizuka, Y. and Araki, K.
  • Journal Title: Cryobiology. Volume: 67 Pages: 188-192
  • DOI: 10.1016/j.cryobiol.2013.06.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] VMAT2 identified as a regulator of late-stage beta cell differentiation. (2013)
  • Author(s): Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., Andersson, O., Stainier, D., Endo, F., Kume, K., Uesugi, M. and Kume, S.
  • Journal Title: Nat. Chem. Biol. Volume: 10 Pages: 141-148
  • DOI: 10.1038/nchembio.1410
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 遺伝子トラップマウスを用いたlincＲＮＡの機能解析 (2013)
  • Author(s): 中原 舞,山添史雅,柳井千佳,吉信公美子,山村研一,荒木正健,荒木喜美
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] c-Ｍaf遺伝子導入ＭＳＭ/Ｍsマウスの作出と解析 (2013)
  • Author(s): 昇地高雅,荒木喜美,舘山浩紀,山村研一,高橋 智
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップクローンの進展 (2013)
  • Author(s): 吉信公美子,來海葉子,慶田貴子,古閑成美,中原 舞,山村研一,荒木喜美,荒木正健
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップ法を用いたLima1/EPLINの骨代謝における機能解析 (2013)
  • Author(s): 黒木修司、関本朝久、舩元太郎、大田智美、中村志保子、山村研一、中原舞、荒木喜美、荒木正健、帖佐悦男
  • Organizer: 第28回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 千葉 幕張メッセ
  • Year and Date: 20131017-20131018
• [Presentation] Analysis of gene-trap mouse lines trapping long non-coding RNA genes.(Part1) (2013)
  • Author(s): 柳井千佳,山添史雅,中原 舞,宮家幹子,森田彩香,荒木美幸,岡本瀬幸,伊東春香,山村研一,吉信久美子,荒木正健,荒木喜美
  • Organizer: 第27回モロシヌス研究会
  • Place of Presentation: つくば市 理研BRC
  • Year and Date: 20130628-20130629
• [Presentation] Analysis of gene-trap mouse lines trapping long non-coding RNA genes.(Part2) (2013)
  • Author(s): 山添史雅,柳井千佳,中原 舞,宮家幹子,森田彩香,荒木美幸,岡本瀬幸,伊東春香,山村研一,吉信久美子,荒木正健,荒木喜美
  • Organizer: 第27回モロシヌス研究会
  • Place of Presentation: つくば市 理研BRC
  • Year and Date: 20130628-20130629
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップ法を用いた骨代謝疾患に関与する新規遺伝子の探索 (2013)
  • Author(s): 関本朝久、黒木修司、舩元太郎、大田智美、中村志保子、濱田浩朗、山村研一、中原舞、荒木喜美、荒木正健、帖佐悦男
  • Organizer: 第86回日本整形外科学会学術総会
  • Place of Presentation: 広島 広島グリーンアリーナ
  • Year and Date: 20130523-20130526