2011 Fiscal Year Annual Research Report
組織ペプチドーム解析を可能とする技術開発と新規生理活性ペプチドの探索・同定
| Project/Area Number |
23310155
|
|---|
| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
|---|
Principal Investigator |
南野 直人 独立行政法人国立循環器病研究センター, 分子薬理部, 部長 (50124839)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 一樹 独立行政法人国立循環器病研究センター, 分子薬理部, 室長 (80260313)
望月 明和 独立行政法人国立循環器病研究センター, 分子薬理部, 研究員 (30589601)
|
|---|
| Keywords | ペプチドーム解析 / ペプチド / プロセシング / 分解ペプチド標識法 / 内在ペプチド / 生理活性ペプチド / 組織ペプチドーム解析 / 質量分析 |
|---|
| Research Abstract |
組織のペプチド総体(ペプチドーム)を解析できれば、生理活性ペプチドの発見や診断法開発などにおいて有効なリソースとなるが、タンパク質の消化・分解に由来するペプチドの生成が不可避で内在ペプチドとの識別できないため、十分な研究が実施できていない。本研究では、内在/分解ペプチドの識別法を作成して、有効な組織ペプチドーム解析を実施可能とする。
本年度は、ラット下垂体、副腎髄質を対象に組織試料の標識試薬添加前および添加後の処理法、標識試薬の脱離条件などを検討した。組織試料を一定時間、標識試薬に浸漬後、急速加熱処理しプロテアーゼを失活させた後、抽出した。逆相カラムで濃縮し、ゲルロ過HPLCで分離したペプチド画分をLC-Maldi法で解析し、試薬導入率は標識/非標識ペプチドのピーク面積比より算出した。4℃、10分程度の標識試薬への浸漬ではほとんど標識されず、消化が推定されるペプチドでも標識率は低かった。標識試薬と組織をホモジナイズ後、熱処理した際は標識が確実に進行し、分解ペプチド(推定)は高い標識率が観測された。試薬の細胞内移行率の低さが原因と考えられ、組織の細片化や消化分散後、標識試薬入り培養液で加温、振盪、灌流などの条件を設定し時間経過と標識率を検討し、生理的条件に近く簡便でかつ短時間に実施できる方法や条件を検討している。実際、副腎髄質のあるタンパク質では、既報の生合成直後の切断部位に由来するペプチドは全く標識されず、他の部位に由来するペプチドには全て高率で標識されており、方法論の正しさは確認された。
一方、標識ペプチドからの試薬脱離を検討した結果、中性条件で3週間、1%TFA条件で室温12時間あるいは50℃で4時間までは試薬の有意な脱離はなく、pH、温度などの保存条件を管理すれば、安定的に標識率を算出できることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養細胞を用いた事前検討では、細胞内への移行は速やかと推定されたが、実際に組織レベルで実施した場合は、小組織の細片でも細胞内への浸透率は低かった。消化・分解ペプチドが高率に標識される条件を設定する必要があるが、生理的条件に近く迅速に実施でき細胞死が起こらないことが必要であり、さらに多くの条件を検討して早期に条件設定する予定である。
スクリーニング法については、広範な探索に適するアポエコーリンマウスを導入済みであり、培養細胞系については既知の生理活性ペプチドを用いて対象細胞の拡大や新規測定法の導入などを進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
標識試薬が細胞内に十分濃度存在すれば、分解ペプチドは確実に標識されるが、予め切断された部位は全く標識されないことを確認している。一方、ペプチドの抽出、調製以降の方法論および構造解析系、標識率の評価系についてはほぼ準備できている。そのため、標識試薬が組織の各細胞内にほぼ均等に浸透、分布し、細胞内タンパク質と十分に接触する状況を作成することが研究推進のための必須条件である。全ての組織には適応できないが、組織の固定用灌流などの手法を応用し、試薬入り培養液が迅速に組織末梢に浸透すれば、細胞移行率も向上する可能性がある。専門家の指導を受けて早期に下垂体や副腎で評価し、もし順調に移行するのであれば、脳のような大きい組織に適用できるかを検討して、初期の標識条件の問題を解決し、研究対象を拡大し、研究を加速、推進する
|
