2013 Fiscal Year Annual Research Report
メタゲノム遺伝子の網羅的発現を目指した大腸菌宿主の開発
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23380197
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
宮崎 健太郎 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 研究グループ長 (60344123)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 16S rRNA / メタゲノム / 翻訳 / リボソーム / 宿主 / 機能改変 |
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| Research Abstract |
本研究では、多様な遺伝子を均等に発現する大腸菌宿主の創成を目的とする。とくに平成25年度は、多様な遺伝子のモデルとして、様々な生物種の遺伝子特性に合わせて合成した緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を発現効率検証用のレポーター遺伝子として用いた。これらを実際に大腸菌に導入した結果、その幾つかについては予想通り、発現レベルの低いことを確認した。
宿主の遺伝子発現効率の改変手段としては、リボソームに着目し、中でも、構造的に中核を担う16S rRNAの遺伝子改変を行った。大腸菌16S rRNAを異種生物由来のものと置換する手法を用いたが、多様な16S rRNA遺伝子獲得のため、環境ゲノムを鋳型としてPCR法により増幅した。次いでrrnオペロン発現ベクターにIn-fusionクローニング法により組み込んだ。こうして得られた異種16S rRNA発現ベクターライブラリーを大腸菌の16S rRNA完全欠損株に導入し、さらに16S rRNA完全欠損株の生育相補に導入してあったレスキュープラスミドをショ糖を用いたカウンターセレクションにより除去した。本工程により、異種16S rRNAにより生育相補可能な変異株のスクリーニングを行った。その結果、多種多様な16S rRNAにより生育を相補された大腸菌変異株を得た。
次に、これらの変異株ライブラリーに上述の各種GFPを形質転換により導入した。コロニーの段階で蛍光にばらつきが生じることが判明し、リボソームを改変することにより、大腸菌の翻訳プロファイルに変化が起きることが確認された。さらに、蛍光強度によるスクリーニングを行い、野生型に匹敵するあるいは凌ぐ変異株を分離することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Meeting Report: 1st International Functional Metagenomics Workshop May 7–8, 2012, St. Jacobs, Ontario, Canada2013
Author(s)
Engel K, Ashby D, Brady SF, Cowan DA, Doemer J, Edwards EA, Fiebig K, Martens EC, McCormac D, Mead DA, Miyazaki K, Moreno-Hagelsieb G, O'Gara F, Reid A, Rose DR, Simonet P, Sjöling S, Smalla K, Streit WR, Tedman-Jones J, Valla S, Wellington EMH, Wu C-C, Liles MR, Neufeld JD, Sessitsch A, Charles TC
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Journal Title
Standards in Genomic Sciences
Volume: 8
Pages: 106-111
DOI
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