2012 Fiscal Year Annual Research Report
Ｒａｃ１活性の光制御によりマクロパイノサイトーシスをコントロールする
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23390039
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
荒木 伸一 香川大学, 医学部, 教授 (10202748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三宅 克也 香川大学, 医学部, 准教授 (30219745)
江上 洋平 香川大学, 医学部, 助教 (80432780)
川合 克久 香川大学, 医学部, 助教 (80534510)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Rac1 / GTPase / 分子スイッチ / マクロパイノサイトーシス / 蛍光イメージング / 光制御 / 細胞骨格 |
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| Research Abstract |
低分子量GTPase分子スイッチの一つであるRac1は、アクチン細胞骨格の重要な調節因子でありアクチン依存性の細胞運動の制御に関わっている。植物の青色光センサーであるphototropinのLOV2ドメインをGTP結合型Rac1に融合させたphoto-activatable (PA)-Rac1は、青色レーザー照射により共焦点顕微鏡下で時空間的に活性化することができる。今回、我々は、このPA－Rac1を発現させたRAWマクロファージに青色レーザーを照射することでRac1のオン・オフを光制御し、アクチン依存性の液相性エンドサイトーシスであるマクロパイサイトーシス過程を顕微鏡下でphoto-manipulationすることに世界で初めて成功した。mCherry融合PA-Rac1を発現させた細胞を顕微鏡下で確認し、その細胞の一部を青色レーザーで照射すると、その領域付近で著しい細胞表層ラッフリングが起こり、多数のマクロパイノゾーム前駆構造が形成された。照射部位にはアクチンの集積やPI(4,5)P2の産生など初期マクロパイノサイトーシス過程のマーカーも確認された。しかし、PI3P, Rab21等マクロパイノゾーム成熟にかかわる分子のリクルートは見られなかった。青色レーザー照射を止めると、ラッフリングはおさまり、マクロパイノゾーム様構造の幾らかはRab21陽性のマクロパイノゾームとして細胞中央へ向かって移動しはじめた。しかし、青色レーザーの長期継続照射では、マクロパイノゾーム前駆構造は細胞外に開口したままで、その領域内で留まり時間経過に伴い増加し続けた。このことは、Rac1の活性化はラッフリングとマクロパイノゾーム前駆構造の形成に必要でマクロパイノゾームの閉鎖と成熟過程への移行には、Rac1の一時的な活性化に続く不活性化が必要であることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PA-Rac1の光制御によりRac１を活性化状態にすることでマクロパイノサイトーシスの初期過程であるrufflingとマクロパイノサイティクカップの形成を誘導することができ、さらに、光照射を止めることでRac1不活性化することでカップの閉鎖とマクロパイノゾーム成熟に関する分子（Rab21,FYVEなど）をリクルートさせることができた。マクロパイノサイトーシスの過程のなかで、Rac1の活性化が必要とされる段階と不活性化が必要とされる段階を区別し顕微鏡下でコントロールすることに成功したので研究はほぼ順調に進展しているといえる。これまでの研究成果は、いくつかの学会で報告し、論文も投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
mCherry融合PA-Rac1とYFP融合シグナル分子の共発現系において、Rac1活性化により誘導される下流分子、不活性化によって初めてリクルートされる分子などがいくつか同定することができた。しかし、共発現によりラッフリング誘導が不安定になったり、シグナル分子のリクルートが不十分になったりする問題が上がってきたため、さらにPI3Kなど下流シグナルとの関連、アクチン制御分子との関連を正確に調べるには、可視化のための標識蛍光タンパク質の組み換えなどの工夫が必要と思われる。
マクロファージ以外の細胞においても、Rac1が関与することが知られているラメリポディア形成、細胞接着進展、細胞移動などおけるRac1分子スイッチのオンとオフ、それぞれの役割解明にPA-Rac１の技術を応用し、研究を発展をさせる。
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Research Products
(4 results)
