2012 Fiscal Year Annual Research Report
難治性血液腫瘍疾患に対する新規治療法の開発と新規細胞死機序の探索
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23390273
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
足立 壯一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10273450)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 難治性血液腫瘍 / 細胞死 / 遺伝子変異 / 遺伝子発現 / 微小残存病変 / 新規予後因子 |
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| Research Abstract |
難治性血液腫瘍疾患の新規治療法の開発を目指し、（１）難治性白血病及び難治性固形腫瘍のin vivoにおける細胞死機序の検索（２）難治性白血病の新規予後因子の検索（３）急性骨髄性白血病(AML)の微少残存病変(MRD)分画における白血病幹細胞の同定と機能の検討、を行う。(1) Ph1陽性白血病患者検体をNOGマウス（免疫不全マウス）に移植した系において、dasatinib投与後のin vivoにおける骨髄、脾臓、肝臓及び中枢神経系おける細胞死の解析を行った。透過型電子顕微鏡で観察したところ、dasatinibを投与した全てのマウス（３匹）において、骨髄、脾臓に加え脳の白血病細胞においてもオートファゴソームの形成が確認できた。骨髄の白血病細胞を用いてLC3タンパクの免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティングを行った。免疫蛍光染色においては、dasatinib投与群においてLC3-IIのドットパターンが、ウェスタンブロッティングにおいては、dasatinib投与群においてLC3-IIバンドの増強が確認され、autophagyが同定された。(2) 小児急性AMLの予後因子解析として、AML-05プロトコール検体を用いて、Evi1の発現量を測定したMLL再構成全体(51例)ではRFSでEVI1(+)が予後不良(P<0.0001)、MLL-AF9（29例）ではRFS、OSともにEVI1(+)が予後不良であった (RFS;P<0.0001、OS;P=0.0008)。(3) ダウン症候群に合併したAML (AML-DS)におけるフローサイトメトリーにおける微小残存病変（MRD）検出システムの確立をAML-DSから樹立した細胞株（KPMA1）を用いて行った。0.01％以上の濃度においてMRDを確実に検出することができ、FACSによるMRD検出の系が十分に確立できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)Ph1陽性白血病をNOGマウスに移植した系において、Ph1白血病の治療薬であるチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）であるdasatinib投与後にin vivoにおいて、骨髄、脾臓、及び中枢神経系にautophagyを初めて検出することに成功した。Autophagyは白血病や癌治療においては、細胞生存の方向に働き、治療失敗につながると考えられる。今回、in vivoにおいて初めてautophagyの現象を証明したことにより、autophagy阻害剤による白血病細胞死増強が期待でき、新規治療法の開発が期待できる。(2)小児AML-05余剰検体を用いて(a)Evi1発現量(b)CEBPA変異(c)c-kit変異解析を行った。(a)MLL-AMLの特に症例数が最も多く、予後中間群とされているMLL-AF9症例（29例）においてEvi1高発現群の予後が全生存率、無病生存率共に不良であった。(b)成人のnormal karyotype群において、CEBPA変異（特に2変異以上）は予後良好因子とされている。AML-05検体では、正常核型76例中、変異なし、46例、1変異18例、2変異以上12例、正常核型以外251例中、変異なし、278例、1変異26例、2変異以上23例となった。全生存率、無病生存率ともいずれの解析結果でもCEBPA変異は予後良好因子とはならなかった。(c)t(8;21)95例中、43例にc-kit変異が同定され、変異例全体では予後の有意差はなかった。しかし、exon 17変異例は無病生存率が有意に不良であり、特にD816V変異例は予後不良であった。(3)AML-DS症例におけるFACSによるMRD検出システムを0.01%まで同定できる系を確立することに成功し、JPLSG AML-D11登録症例の中央診断施設としてすでに5例の症例でMRD解析を施行した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)In vivoでautophagyを同定した免疫不全マウスにPh1陽性白血病細胞株を移植した系において、autophagy阻害剤（Chroloquine等）を投与することにより、白血病細胞死がin vivoで増強するかどうかを検証する。従来のTKIでは、治療効果の全くないBcr-Abl陽性白血病（慢性骨髄性白血病及びPh1陽性急性リンパ性白血病）としてT315変異が報告されているが、近年、PonatinibがT315変異陽性例にも有効であり、アメリカにて臨床試験が開始されている。すでに、T315変異白血病細胞株に、in vitroでponatinibを投与した系においてapoptosisを抑制した条件でautophagyを確認しているが、in vivoにおいてもponatinib投与時にautophagyが観察されるかどうか検討する。(2) AML細胞株にc-kit変異（D816V、N822K）を導入し、細胞増殖曲線及び種々の抗癌剤(Ara-C, VP16)に対する細胞死誘導効果及び機序の解析を行う。Evi1高発現である、MLL-AF9白血病細胞株(4166細胞)のEvi1発現量を低下させた細胞株を樹立し、細胞増殖曲線及び種々の抗癌剤(Ara-C, VP16)に対する細胞死誘導効果及び機序の解析を行う。AML-05検体のCEBPA変異及びc-kit変異解析を次世代シークエンサー法で行い、direct sequence法との相違を確認する。(3) 引き続きJPLSG臨床試験である、AML-D11の中央診断施設として、FACSによるMRD解析を継続するとともに、再発、難治AML臨床試験（AML-R11）の登録症例についても、中央診断施設としてFACSによるMRD解析を行う。ダウン症合併白血病症例と非ダウン白血病症例で、骨髄回復期の抗原発現の違いを検討する。
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Research Products
(18 results)
